复合氨基酸对断奶仔猪背最长肌生长的影响

纪昌正 ，田俊杰，朱哲坤，王 倩，孟禹璇，李宝成，王 蕾,2，侯永清,2*

（1.武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室，湖北武汉 430023；2.武汉轻工大学动物营养与饲料安全湖北省协同创新中心，湖北武汉 430023）

随着我国畜牧业的快速发展以及人民生活水平的提高，人们对畜产品的要求也不断提高，猪的瘦肉（肌肉）质量受到广泛关注。功能性氨基酸对动物的生长和发育以及营养物质代谢等生命活动发挥着重要的生理作用[1]。谷氨酸（Glutamate，Glu）参与调控机体其他氨基酸的代谢，对动物的应激反应和免疫功能等方面起着重要作用，是动物最佳生长和健康所必需的一种氨基酸[2]。谷氨酰胺（Glutamine，Gln）可以促进血清蛋白的合成并提高肌肉组织的抗氧化能力[3]。精氨酸（Arginine，Arg）可促进机体蛋白质合成及抑制其降解，适宜的精氨酸需要量能够促进新生仔猪的生长[4]。Powell 等[5]研究发现，甘氨酸（Glycine，Gly）能够提高仔猪的日增重和饲料转化率，对仔猪的生长发育起着重要的作用。另外，甘氨酸还是一种有效的抗氧化剂，可清除体内自由基，提高机体免疫力[6]。N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）对刺激引起的肌肉能量消耗具有缓解作用[7]。

功能性氨基酸作为合成多种具有重要功能生物活性分子的必需前体物，参与调节动物的新陈代谢途径，对维持动物正常的生长、发育和繁殖都发挥着至关重要的作用[8]。国内外关于各种功能性氨基酸的报道已有很多，但将多种功能性氨基酸按一定比例制成复合物，对仔猪肌肉生长影响的相关报道还很少。前期研究表明，添加1.0% 复合氨基酸可显著降低仔猪腹泻率，对仔猪生长性能无显著影响[9]。本试验旨在研究复合氨基酸对仔猪背最长肌生长的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料 试验用谷氨酸（G103978，99%）、谷氨酰胺（G105425，99%）、精氨酸（A108220，98%）、甘氨酸（A111465，≥99%）、N-乙酰半胱氨酸（A105420，99%）为上海阿拉丁生化科技股份有限公司产品。

根据前期预试验结果确定了复合氨基酸的组成和比例，即复合氨基酸按谷氨酸:谷氨酰胺:甘氨酸:精氨酸:N-乙酰半胱氨酸为5:2:2:1:0.5 的比例混合制成。

1.2 试验动物与试验设计 试验选用16 头24 日龄体重（5.49±0.35）kg、健康杜× 长× 大断奶仔猪，随机分为对照组和复合氨基酸组，每组8 个重复，每个重复1 头猪。各组基础日粮一致，对照组饲喂基础日粮+0.99%的丙氨酸（等氮控制），复合氨基酸组饲喂基础日粮+1.0%的复合氨基酸，试验期为21 d。

1.3 试验日粮 基础日粮参照NRC（2012）猪的营养需要标准配制，日粮的组成及营养成分见表1。

表1 基础日粮组成及营养成分（风干基础）

1.4 饲养管理 猪舍为全封闭式，进猪前对猪舍及猪笼彻底清洗猪舍并消毒。仔猪饲养在不锈钢试验笼中，试验期间保持猪舍通风良好，维持室温在22～25℃；由鸭嘴式饮水器供水；每天饲喂5 次，分别在8:00、12:00、15:00、18:00、22:00 饲喂，保证自由采食，自由饮水；每天清扫猪舍1 次，每天用消毒液进行圈舍消毒。

1.5 样品采集 于试验第21 天，待所有仔猪完全麻醉后屠宰。将背部皮肤剖开，取中间段背最长肌，剪成小块分装在冻存管中，立即装入纱布袋放入液氮中冻存，再转至-80℃保存待测。

1.6 检测指标与方法

1.6.1 背最长肌生长指标 用John Chandler 法[10]提取组织匀浆液中的DNA 和RNA，用紫外吸收法测定提取液中RNA 和DNA 水平。总蛋白测定方法参照试剂（南京建成生物工程研究所）所附说明书。

1.6.2 背最长肌游离氨基酸含量 采用德国SYKAM S-433D 型氨基酸分析仪检测背最长肌游离氨基酸含量。

1.6.3 背最长肌生长和氨基酸转运载体相关基因相对表达量的检测 采用TRIzo（lTaKaRa，大连）一步抽提法，提取背最长肌研磨样品中的总RNA，在保证RNA 纯度合格（A260/A280=1.7～2.1，且A260/A230＞2）且未降解的前提下，根据PrimeScript®RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，大连）试剂盒的方法步骤对RNA 进行反转录，合成cDNA，然后再采用实时荧光定量PCR（qPCR）的方法，以RPL4基因为内参进行检测。各个基因qPCR 的数据结果统一参照Fu 等[11]的方法进行统计分析。检测的基因序列见表2。

1.7 统计分析 数据采用SPSS 17.0 统计软件进行单因素方差分析，结果用平均值± 标准差表示，以P＜0.05作为差异显著性判断标准，P＜0.1 为具有显著性趋势。

2 结果

2.1 复合氨基酸对背最长肌生长的影响 从表3 可以看出，与对照组相比，复合氨基酸组提高了背最长肌蛋白质含量和蛋白质/DNA（P＜0.05），降低了RNA/DNA（P＜0.05）；有降低RNA 含量的趋势（P＜0.1），其他指标差异不显著。

2.2 复合氨基酸对仔猪背最长肌游离氨基酸的影响 从表4 可以看出，与对照组相比，复合氨基酸组显著提高了背最长肌缬氨酸、组氨酸、3-甲基组氨酸和精氨酸的含量（P＜0.05）；降低了背最长肌苏氨酸、谷氨酰胺、β-丙氨酸、赖氨酸和氧化型谷胱甘肽（GSSG）的含量（P＜0.05）；其他氨基酸含量差异不显著。

表2 检测基因的引物序列

表3 复合氨基酸对背最长肌生长的影响

2.3 复合氨基酸对背最长肌相关基因相对表达量的影响由表5 可知，与对照组相比，复合氨基酸组显著上调了仔猪背最长肌PepT1和b0,+AT基因的相对表达量（P＜0.05），显著下调了仔猪背最长肌MSTN基因的相对表达量（P＜0.05）；其他基因的相对表达量差异不显著。

3 讨 论

3.1 复合氨基酸对肌肉组织生长的影响 蛋白质是生命活动的重要承担者，影响各种酶的合成、细胞生长等。DNA 浓度、RNA/DNA 比值和蛋白质/DNA 比值可以说明细胞的发育、代谢情况等，可用于评估肌肉生长情况[12]。DNA 浓度反映有丝分裂产生新的细胞的速度，RNA/DNA 比值可以衡量细胞的增长速率，蛋白质/DNA比值表示细胞中蛋白合成的效率[13-14]。本试验结果表明，复合氨基酸组背最长肌蛋白质含量和蛋白质/DNA显著升高，说明添加复合氨基酸可以促进背最长肌细胞的蛋白合成，代谢加快。大量研究表明，谷氨酰胺、精氨酸、甘氨酸和N-乙酰半胱氨酸可以通过mTOR 信号通路促进蛋白的合成，谷氨酸和精氨酸的代谢产物多胺对DNA 和蛋白的合成有重要作用[15-19]。这表明复合氨基酸对背最长肌的合成有促进作用。

表4 复合氨基酸对仔猪背最长肌游离氨基酸的影响

表5 复合氨基酸对背最长肌相关基因相对表达量的影响

3.2 复合氨基酸对背最长肌游离氨基酸含量的影响 本试验研究发现，日粮中添加复合氨基酸显著提高了背最长肌精氨酸水平，提示复合氨基酸可能会影响机体肾脏功能或蛋白质代谢。对仔猪来说，精氨酸是一种必需氨基酸，对动物的生长和免疫有重要作用[20]。研究表明，支链氨基酸中的缬氨酸是猪必需氨基酸，对机体代谢有着重要的生物学作用。缬氨酸是生长肥育猪肌肉蛋白质合成的必需氨基酸[21]。组氨酸是可以组成蛋白组结构的一种含有咪唑杂环的氨基酸，参与机体蛋白质合成，还是生理活性物质的成分，具有清除细胞内氧化物和参与免疫调节作用等[22]。本试验研究表明，添加复合氨基酸可以提高背最长肌缬氨酸、组氨酸、3-甲基组氨酸的含量，表明复合氨基酸通过调节背最长肌氨基酸水平从而促进背最长肌的生长。

3.3 复合氨基酸对背最长肌生长及氨基酸转运载体相关基因表达量的影响 本试验研究表明，添加复合氨基酸显著提高了背最长肌PepT1基因的相对表达量。Shiraga 等[23]的研究亦表明，日粮中二肽和游离氨基酸浓度增加，PepT1基因的转录活性增强，其对二肽的转运活性增强，进而使PepT1在细胞膜上的表达增多。氨基酸转运载体b0,+AT在氨基酸转运吸收中有着重要作用。有研究表明，断奶仔猪日粮中添加精氨酸，b0,+AT表达增加，小肠内精氨酸转运吸收能力增强，从而对缓解仔猪断奶应激和促进肠道黏膜修复起到一定作用[24]。本试验研究结果显示，添加复合氨基酸可显著上调b0,+AT基因的表达量，说明复合氨基酸通过调节氨基酸代谢相关的基因表达促进背最长肌的氨基酸代谢，进而影响背最长肌的生长。肌肉生长抑制素（Myosmfin，MSTN）基因也称GDF-8（Growth And Different-Tiation Factor 8）基因是转化生长因子β超家族的成员，是骨骼肌生长的抑制因子[25]，它通过抑制MyoD家族成员转录活性来抑制肌细胞的生长发育，其表达量与肌肉重量的变化呈负相关[26]。本试验研究结果显示，添加复合氨基酸组仔猪背最长肌MSTN基因相对表达量显著低于对照组，表明复合氨基酸通过降低肌肉生长抑制因子的表达促进背最长肌的生长。

4 结 论

复合氨基酸可以促进背最长肌蛋白质的合成，调节氨基酸代谢，抑制肌肉生长抑制因子的表达，对断奶仔猪背最长肌的生长有促进作用。