山萘酚对人肝癌Bel-7402细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响
2020-12-21仲富瑞程宦立杜毅超胡启辉付文广夏先明
仲富瑞, 程宦立, 张 浩, 杜毅超,b, 胡启辉, 付文广,b, 夏先明,b
西南医科大学附属医院 a. 肝胆外科； b. 四川省院士(专家)工作站， 四川 泸州 64600
Effectofkaempferolontheproliferation,migration,invasion,andapoptosisofhumanhepatomaBel-7402cells
ZHONGFuruia,CHENGHuanlia,ZHANGHaoa,DUYichaoa,b,HUQihuia,FUWenguanga,b,XIAXianminga,b.
(a.DepartmentofHepatobiliarySurgery,b.Academician(Expert)WorkstationofSichuanProvince,TheAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan64600,China)
Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of kaempferol on the proliferation, migration, invasion, and apoptosis of human hepatoma Bel-7402 cells and related molecular mechanism.MethodsHepatoma Bel-7402 cells cultured in vitro were randomly divided into control group and low-, middle-, and high-concentration experimental groups. The experimental groups were treated with low-, middle-, and high-concentration kaempferol (25, 50, and 100 μmol/L), and the control group was treated with an equal volume of dimethyl sulfoxide. CCK-8 assay was used to observe the effect of kaempferol on the viability of Bel-7402 cells; plate colony formation assay was used to evaluate the effect of kaempferol on cell colony formation ability; wound healing assay and Transwell chamber were used to observe the effect of kaempferol on cell migration and invasion; Western blot was used to measure the expression of apoptosis- and cycle-related proteins. A one-way analysis of variance was used for comparison between multiple groups, and the least significant differencet-test was used for further comparison between two groups.ResultsAfter 24 hours of treatment, the cell viability was 100.00%±2.72% in the control group and 75.70%±2.42%, 62.79%±2.45%, and 43.41%±2.11%, respectively, in the low-, middle-, and high-concentration experimental groups, and compared with the control group, the experimental groups had a significant reduction in cell viability (allP<0.05). The number of cell colonies was 923.3±35.2 in the control group and 682.7±24.4, 464.0±22.0, and 327.3±14.0, respectively, in the low-, middle-, and high-concentration experimental groups, and compared with the control group, the experimental groups had a significant reduction in cell colony formation ability (allP<0.05). After 24 hours of treatment, the relative migration rate was 100.00%±1.11% in the control group and 63.33%±1.16%, 51.72%±3.23%, and 37.18%±2.71%, respectively, in the low-, middle-, and high-concentration experimental groups, and the number of transmembrane cells was 212.0±3.0 in the control group and 134.0±2.0, 71.0±2.0, and 34.0±1.0, respectively, in the low-, middle-, and high-concentration experimental groups; compared with the control group, the experimental groups had significant reductions in relative migration rate and number of transmembrane cells (allP<0.05). After 48 hours of treatment, compared with the control group, the low-, middle-, and high-concentration experimental groups had a significant reduction in the expression of the anti-apoptotic protein Bcl-2 (allP<0.05), a significant increase in the expression of the pro-apoptotic protein Bax (allP<0.05), and a significant reduction in the expression of C
Keywords：kaempferol; liver neoplasms; cell proliferation; cell movement; apoptosis
原发性肝癌是人类消化系统最常见的癌症之一[1]，在我国尤为高发,具有恶性程度高、复发率高、转移率高的特点[2]。随着手术切除、射频消融、靶向治疗等治疗手段不断发展，肝癌患者的预后得到了一定改善，但治疗后的复发率仍较高，整体的5年生存率仍不理想[3]，因此寻找有效地抑制肝癌细胞增殖和转移的天然药物，无疑具有重大意义。山萘酚(Kaempferol, KA)是一种从传统中药赶黄草中提取的天然黄酮类化合物，现代药理研究[4]发现KA具有抗氧化、抗炎、抗癌等多种药理活性，且有研究证明KA能够通过不同的机制抑制卵巢癌[5]、结直肠癌[6]等癌细胞增殖转移，促进癌细胞凋亡。但KA在肝癌中的基础研究较少，故本研究通过体外实验，探讨KA对肝癌Bel-7402细胞体外克隆形成、增殖、侵袭迁移、凋亡的影响，也将阐述可能的分子机制，以期为KA用于新药开发及肝癌的临床治疗提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料 肝癌Bel-7402细胞为本实验室保存，高糖DMEM培养基和胎牛血清购自美上海中乔新舟生物科技有限公司，山萘酚、结晶紫购于上海麦克林生化科技有限公司，CCK-8试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、ECL化学发光试剂盒、一抗Bcl-2、Bax、cyclin D1、GAPDH及二抗均购自上海碧云天生物科技有限公司。
1.2 研究方法
1.2.1 细胞培养 将肝癌Bel-7402细胞置于含10%胎牛血清、1%青链霉素的高糖DMEM培养液中放于恒温培养箱(5%CO2、37 ℃)中常规传代培养，维持细胞处于对数生长期。
1.2.2 实验分组 将处于对数生长期的肝癌Bel-7402细胞随机分为对照组和实验组，实验组分别予以含低浓度KA(25 μmol/L)、中浓度KA(50 μmol/L)、高浓度KA (100 μmol/L)的培养液处理，对照组给予含等量二甲基亚砜(DMSO)的培养液处理。
1.2.3 细胞增殖能力的检测 采用CCK-8试剂盒检测KA对肝癌Bel-7402细胞增殖的影响。将细胞接种于96孔板中，分组及干预方法同1.2.2，培养24、48、72 h后，在实验结束前2 h每孔加入CCK-8溶液10 μl培养2 h，再用酶标仪450 nm处测定吸光度(OD)值，计算细胞活力。
1.2.4 细胞克隆形成检测 取对数生长期的Bel-7402细胞，以约1000个/孔的密度将细胞接种于6孔板中，细胞分组及干预同1.2.2，置于培养箱中连续培养10 d左右，然后以4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗后结晶紫染色15 min，双蒸水漂洗后置于空气中干燥，最后拍照计数。
1.2.5 细胞迁移能力的检测 采用划痕试验检测KA对Bel-7402肝癌细胞的迁移能力的影响。取对数生长期细胞配制成细胞悬液,铺于6孔板中培养，待细胞基本长满后，在每孔底部划出3条均匀竖线，PBS洗涤2次后于倒置显微镜下观察作为0时状态，并标记每个观察点，再更换为含不同浓度KA(0、25、50、100 μmol/L)的完全培养基继续培养，于不同时间(24、48 h)在倒置显微镜下拍照，记录同一个观察点划痕宽度的变化，计算各组细胞的相对迁移率。
1.2.6 Transwell小室侵袭实验 采用Transwell小室检测KA对肿瘤细胞侵袭能力的影响。无菌条件下Matrigel(基质胶)于冰浴融化，用DMEM培养液稀释成1 g/L，取50 μl铺于Transwell上室，Transwell下室每孔加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培养基，上室加入Bel-7402肝癌细胞，调整细胞浓度为4×105/ml，每孔50 μl，设KA低、中、高浓度实验组及对照组，分组后加入不同浓度的KA(25、50、100 μmol/L)及溶媒DMSO对上室细胞进行干预。培养24 h后，去除上室中培养液，用棉签轻轻擦去上层中的细胞，4%多聚甲醛中固定20 min，PBS洗涤2次，结晶紫染色15 min，再用PBS洗涤，在倒置显微镜下拍照计数穿过小室的细胞。
1.2.7 Western Blot法检测Bcl-2、Bax、CyclinD1及GADPH蛋白表达水平 取对数生长期的Bel-7402细胞接种于6孔板，置于细胞培养箱中培养24 h后，更换为含有不同浓度KA(0、25、50、100 μmol/L)的完全培养基，48 h后收集细胞并将各组细胞裂解，按照蛋白提取试剂盒说明书提取蛋白，使用BCA法测量蛋白浓度并定量。将定量后的各实验组和对照组分别取等量总蛋白上样，进行SDS-PAGE凝胶电泳分离并转至PVDF膜上，将膜置于用PBST配制的含5%脱脂奶粉的蛋白封闭液中封闭2 h，一抗孵育过夜(4 ℃)。次日PBST避光漂洗3次后二抗室温孵育1.5 h，PBST漂洗3次，最后使用ECL化学发光试剂盒进行曝光，凝胶成像系统分析。
2 结果
2.1 KA对肝癌Bel-7402细胞增殖的影响 各组处理Bel-7402细胞24、48、72 h后，Bel-7402细胞的对照组和低、中、高浓度组在各时间点的细胞活力为24 h：(100.00±2.72)%、(75.70±2.42)%、(62.79±2.45)%、(43.41±2.11)%; 48 h：(100.00±2.81)%、(71.19±3.13)%、(53.53±3.44)%、(39.44±3.60)%; 72 h: (100.00±4.06)%、(72.65±3.32)%、(52.42±1.70)%、(34.12±1.41)%。结果显示，相比于对照组，3个时间点的各实验组Bel-7402细胞的相对活力均明显下降(P值均<0.05)(图1)。
2.2 KA对肝癌Bel-7402细胞克隆形成的影响 对照组和低、中、高浓度组Bel-7402细胞的细胞克隆形成数分别为：923.3±35.2、682.7±24.4、464.0±22.0、327.3±14.0。相比于对照组，各实验组Bel-7402细胞的克隆形成数目呈剂量依赖性减少(P值均<0.05)(图 2)。
2.3 KA对肝癌Bel-7402细胞迁移能力的影响 对照组和低、中、高浓度组Bel-7402细胞的相对迁移率在24 h为：(100.00±1.11)%、(63.33±1.16)%、(51.72±3.23)%、(37.18±2.71)%；48 h为：(100.00±2.90)%、(58.12±2.80)%、(36.81±3.19)%、(36.39±3.30)%。结果显示，相对于对照组，各实验组在24 h和48 hBel-7402细胞的迁移能力均显著下降(P值均<0.05)(图3)。
2.4 KA对肝癌Bel-7402细胞侵袭能力的影响 各组处理细胞24 h后，对照组和低、中、高浓度组穿过Transwell小室的Bel-7402细胞数目分别为212.0±3.0、134.0±2.0、71.0±2.0、34.0±1.0。结果显示，与对照组相比，各实验组穿过Transwell小室的细胞数目明显减少(P值均<0.05)(图4)。
2.5 KA对肝癌Bel-7402细胞凋亡及细胞周期相关蛋白表达的影响 各组处理细胞48 h后，Western Blot结果显示，与对照组相比，各实验组下调了Bel-7402细胞中抗凋亡Bcl-2蛋白的表达(P值均<0.05)，上调了Bel-7402细胞中促凋亡蛋白Bax的表达(P值均<0.05)，且下调了Bel-7402细胞中周期相关蛋白Cyclin D1的表达(P值均<0.05)(图5，表1)。
表1 各组Bel-7402细胞相关蛋白相对表达水平的比较
3 讨论
肝癌是全世界最常见的侵袭性癌症之一[7]，大多数肝癌患者早期症状不明显，确诊时已是晚期，已不再适合采用手术切除方式治疗[8]。由于肝癌内在的药物代谢活性，使其对化疗存在一定的抵抗性[9]，且常规化疗药物长期使用会产生不良反应和耐药性，也限制了其在临床上的应用。KA因其抗炎、抗氧化等优点，在世界范围内受到越来越多的关注，有研究[10]表明山萘酚通过下调microRNA-21的表达，从而抑制肝癌HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭，还有研究[11]显示KA通过AMPK及AKT途径诱导自噬，对肝癌SK-HEP-1细胞产生抗增殖作用。但肝癌由于致病因素多变导致了不同患者间的异质性[12]，在肝癌的进展过程中体内微环境的变化会进一步促进其体内肝癌细胞发生变异，产生更多细胞克隆亚型[13]，从而导致肝癌的高度异质性，而高度异质性是肝癌难以治疗的主要原因之一，所以同一药物对不同的肝癌细胞发挥的效应及分子机制也不尽相同。KA对肝癌细胞的研究限于肝癌 HepG2和SK-HEP-1细胞等，且两者抗癌效应的相关机制不一，故有关KA对于肝癌细胞的作用有必要进一步探究。目前KA对肝癌Bel-7402细胞的影响及其可能机制未见相关报道。
本实验用梯度浓度的KA分别处理肝癌Bel-7402细胞，与对照组进行比较，发现经KA干预后的Bel-7402细胞，其细胞活力、迁移及侵袭能力均受到明显抑制。细胞凋亡是一种严格受基因调控的程序性死亡方式[14-15]，癌细胞通过多种方式异常激活抗凋亡蛋白的活性和抑制促凋亡蛋白活性[16]，从而逃避凋亡，该过程的异常与肿瘤的发生、发展密切相关。细胞增殖的基础是细胞周期的有序进行，癌症的难治愈性正是因异常的癌细胞周期而导致其无限增殖[17]，因此研究细胞凋亡与细胞周期的调控因子是癌症研究的重点，故本实验通过检测细胞凋亡与细胞周期相关蛋白的表达水平来探究KA的抗癌效应。
Bax是一种促凋亡因子,而Bcl-2是抗凋亡因子，同属Bcl-2基因家族, Bcl-2家族是细胞凋亡的主要调控因素[18]。本研究结果显示，与对照组相比，不同浓度KA处理Bel-7402细胞后，出现Bcl-2表达明显下调和Bax表达明显上调的现象，提示KA可能通过抑制Bcl-2的表达和促进Bax表达来诱导肿瘤细胞发生凋亡。CyclinD1是G1期细胞周期蛋白，在多种肿瘤中都有CylinD1的高表达。CyclinD1使下游的Rb蛋白磷酸化，从而释放出转录因子E2F，使细胞从G1期进入S期从而促进细胞分裂增殖[19]。在本研究中，与对照组相比，不同浓度KA处理Bel-7402细胞后，CyclinD1蛋白的表达均明显下调，提示KA可能通过抑制CyclinD1因子的表达使Bel-7402细胞阻滞于G1期, 从而抑制肝癌Bel-7402细胞的快速增殖。
综上所述，本研究表明KA能显著抑制Bel-7402细胞增殖、迁移和侵袭。同时，各实验组均明显上调Bax、下调Bcl-2和CyclinD1的表达水平，表明KA可有效诱导肝癌Bel-7402细胞凋亡与抑制其增殖，其作用机制可能与调控凋亡蛋白Bax/Bcl-2以及周期蛋白CyclinD1的表达有关。
利益冲突声明：本研究不存在研究者以及与公开研究成果有关的利益冲突，特此声明。
作者贡献声明：仲富瑞、杜毅超、付文广负责课题设计，资料分析，撰写论文；程宦立、张浩、胡启辉参与收集数据，修改论文；夏先明等负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。
