先天性外中耳畸形(12)——耳郭软骨成分与生物力学性能*

张天宇 卢鑫雨 傅窈窈

耳郭软骨组织工程是先天性外中耳畸形修复的重要研究方向之一，可以避免肋软骨切取所造成的供区并发症，并减少因术者支架雕刻水平而造成的耳郭外形差异。软骨组织工程经过近20年的发展，在种子细胞、支架材料、细胞因子三方面均进行了积极的探索，但组织工程软骨生物力学性能不足，不能对抗皮瓣的回缩仍是限制其临床转化的重要瓶颈。

除由脂肪组织构成的耳垂外，耳郭软骨存在于耳郭的所有部位，并被软骨膜所包围。耳郭软骨属于弹性软骨，其细胞外基质成分和组织形态与透明软骨(关节软骨、鼻中隔软骨、肋软骨)、纤维软骨(椎间盘、半月板)不同，目前透明软骨和纤维软骨的生化性能和生物力学性能已经得到了广泛研究[1～3]，但少有关于弹性软骨的力学性能研究数据[4]。

众所周知，软骨组织的生物力学性能主要取决于其特定的组成和结构。耳郭软骨由软骨膜、软骨细胞和细胞外基质(extracellular matrix, ECM)构成。本文主要介绍现阶段关于天然耳郭软骨组织构成和生物力学性能的研究进展，为进一步优化现有的组织工程软骨提供依据。

1 软骨膜和软骨细胞对生物力学性能的影响

曾有学者报道过软骨膜对软骨组织生物力学性能的影响，如：Roy 等[5]采用大挠度弾性模型描述了软骨组织在三点弯曲试验中的拉伸弹性模量，发现带有软骨膜的软骨组织中，远离负荷施加器一侧的组织比朝向负荷施加器一侧的组织具有更高的模量，推测软骨膜可能使得软骨组织变得更硬。

部分学者支持细胞-机械学说，认为软骨细胞内的脂滴、细胞丝等超微结构能够影响软骨组织的生物力学性能，但这种说法仅为一种推测。上世纪曾有不少学者陆续观察了各种哺乳动物(大鼠、小鼠、家兔等)耳郭软骨组织的超微结构，均报道过脂滴的存在[6～10]。一般认为，软骨细胞中脂滴的存在具有永久性特征[9]，且脂滴并不是单独存在的，周围通常有细胞丝的紧密结合。软骨细胞中脂滴的这些结构特征与白色脂肪细胞中的脂滴极为相似[6,9,11]，某些软骨细胞(如大鼠耳郭软骨组织中央区软骨细胞)本身就具有完全脂肪化的表型特点，有学者将这种印戒状的软骨细胞称为“脂软骨细胞”[9]。

早在19世纪就有学者曾经提出耳郭软骨细胞中的脂滴不能单纯视为化学能的储存形式，Sacerdotti等[12]对成年家兔进行了饥饿实验，发现即使在家兔体重由于饥饿而减少50%的情况下，家兔耳郭软骨细胞内脂滴的含量也没有任何变化。对狗、猫、大象会厌软骨的解剖发现其弹性软骨部分或全部被白色脂肪组织取代，结合前文所述软骨细胞与白色脂肪细胞结构的相似性，推测两类细胞中的脂滴可能具有相似的生物力学功能[9]。另外，胞质细丝属于细胞骨架的一种成分，很可能赋予细胞结构刚性[6]，其与脂滴之间的特殊结构关系是否与软骨组织的生物力学性能相关值得进一步探究。

2 弹性纤维对耳郭软骨生物力学性能的影响

相比于软骨膜和软骨细胞，软骨基质成分与软骨组织的力学特性相关性更明确。弹性软骨基质成分主要包括水、糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、胶原纤维和弹性纤维等，其中，弹性纤维的广泛存在是弹性软骨与其他软骨亚型的主要区别[3]。电镜下，弹性纤维由两部分组成，核心部分电子密度较低，为均质无定形的弹性蛋白；外周覆盖电子密度较高的微原纤维，主要由原纤维蛋白构成；弹性蛋白主要提供弹性，在拉伸后表现出反冲能力[13]，微原纤维被认为对某些解剖位置具有锚定功能。

通常所说的弹性纤维其实包括三种不同结构的纤维成分[14]：Oxytalan纤维、Elaunin纤维和弹性纤维，但往往被统称为“弹性纤维”或“弹性蛋白相关纤维”。Cotta-Pereira等[14]认为这三种不同的弹性蛋白相关纤维可能反映弹性纤维成熟的系列过程；其中，Oxytalan纤维不含弹性蛋白，由直径10～14 nm的微纤维束组成；Elaunin纤维由微纤维和交联的弹性蛋白组成，微纤维是其主要成分；而弹性纤维的主体成分是弹性蛋白[15]。分子组合实验表明，富含纤维蛋白的微纤维比弹性蛋白硬两个数量级[16]。鉴于这三种纤维中弹性蛋白和微纤维的相对含量不同，有人推测这些纤维具有不同的力学性能，亦即Elaunin纤维的弹性性能介于Oxytalan纤维和弹性纤维之间[16]。由于人体主要大血管(主动脉等)中弹性纤维占比高达28%～32%(干重)[17]，因此，针对弹性纤维机械功能和生物力学性能的研究主要集中于心血管领域。由于耳郭软骨包含广泛的弹性纤维网络，在评估弹性软骨的力学特性时，必须考虑弹性纤维的机械功能。迄今为止，尚无文献报道耳郭软骨中这三种纤维的相对含量，亦无弹性纤维在耳郭软骨中直接机械作用的报道。

在耳郭软骨中，弹性纤维形成三维蜂窝状网络环绕着软骨细胞，有学者推测这个网络的功能是允许较大形变的发生[4, 18]。Roy等[5]对比了天然肋软骨、耳郭软骨和组织工程耳郭软骨的大挠度弯曲行为，发现耳郭软骨的弯曲模量明显低于肋软骨，进一步说明了弹性纤维的作用。Pelinitz等[18]发现成人的耳郭长度、宽度会随着年龄的增长而继续增长，认为这种现象可以归因于弹性纤维网络结构的变化和弹性蛋白的降解。Ito等[19]观察了不同年龄段人耳软骨弹性纤维的超微结构，发现随着年龄的增长，耳郭软骨弹性纤维的厚度变得越来越不均匀，他们认为这种弹性纤维的结构变化是成年后耳郭软骨继续增长的原因之一。尽管目前并无直接实验证据表明弹性纤维对耳郭软骨组织生物力学性能的影响，但这些发现都为耳郭软骨中弹性纤维影响生物力学性能提供了间接依据。

3 胶原纤维和蛋白多糖对耳郭软骨的生物力学影响

胶原纤维和蛋白多糖不仅存在于弹性软骨基质，也存在于透明软骨和纤维软骨基质。目前，这两种成分对关节软骨生物力学性能的影响已经得到了广泛和深入的研究。

胶原纤维主要由胶原蛋白先组合成三股螺旋结构，后者相互盘绕形成胶原原纤维，胶原原纤维共价交联后形成具有特定生物力学性能的胶原纤维。有证据支持胶原蛋白的生物力学性能与弹性蛋白不同，Gosline等[20～22]测量了主要由胶原蛋白构成的哺乳动物肌腱和主要由弹性蛋白构成的牛韧带之间生物力学性能的差异，发现弹性蛋白的弹性模量为0.001 1 GPa，延展率为1.5，韧性为1.6 MJ/m3, 顺应性为 90%；相比之下，虽然胶原蛋白顺应性与弹性蛋白类似(90%)，但其延展率仅为0.13，韧性为6 MJ/m3，弹性模量(1.2 GPa)为弹性蛋白的1 000倍。因此，胶原纤维的力学性能很可能与弹性纤维不同，二者含量比值、纤维分布及取向均对组织生物力学性能有显著影响[23,24]。有学者曾提出，在血管中弹性纤维决定了血管伸展时的硬度，而胶原纤维形成了一个不可拉伸的网，防止血管的扩张超过弹性纤维的屈服点[25]。

蛋白多糖由一个中央蛋白核心和连接其上的多达150多个多糖侧链(糖胺聚糖链)构成，许多蛋白多糖分子连接于一个长链透明质酸上形成复杂的蛋白多糖聚合体，固定于胶原纤维形成的三维网络中[26]。糖胺聚糖侧链至少有一个带负电荷的基团(羧基或硫酸盐等)，这些带电基团产生很高的净负电荷密度，后者又能产生电荷依赖性渗透膨胀压力并对软骨组织的生物力学性能产生影响[26]。一般认为，胶原纤维网络产生的内部拉伸应力可以平衡带有很高净负电荷密度的蛋白多糖聚合体产生的渗透膨胀压力[26]。

此外，胶原纤维的交联亦被认为能够影响组织的力学性能。Elbjeirami等[27]利用赖氨酰氧化酶(lysine oxidase，LO)对细胞外基质中的胶原蛋白进行广泛交联，他们将LO基因通过脂质体转染的方式导入血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VMSC)，并将 VMSC 接种于胶原纤维凝胶中，发现与对照组相比，转染LO基因的VMSC接种的胶原凝胶显示出更高的拉伸强度和弹性模量，但二者胶原蛋白水平、弹性蛋白水平和细胞增殖速率均无明显差异，认为胶原纤维的交联能够改变凝胶的生物力学性能。Bastiaansen-jenniskens等[28]将牛关节软骨细胞置于海藻酸钠微球中培养并使用交联抑制剂β-氨基丙腈(β-aminopropionitrile，BAPN)调控细胞外基质中胶原网络的形成，发现在BAPN存在的条件下经过70天的培养后，仅仅增加胶原纤维的数目，不能改善组织的生物力学性能，细胞外基质平衡模量的增加需要更高的胶原交联水平，证明较高的胶原交联水平有助于提高软骨组织的机械强度和硬度。

4 结语

目前透明软骨和纤维软骨的生化性能和生物力学性能已经得到了广泛研究，但少有关于耳郭组织的弹性软骨的机械学测量和生物化学数据；耳郭软骨的特殊结构相关的生物力学性能是完善组织工程软骨临床转化的重要内容之一。本文综述了目前已知的耳郭软骨中各个组成部分(软骨膜、软骨细胞及软骨基质中的不同成分)对软骨生物力学性能的影响，重点是耳郭软骨的特殊结构——弹性纤维对力学性能的影响，为软骨组织工程的进一步发展提供依据。