抗肿瘤血管生成治疗联合免疫治疗的理论基础与前景

施成炜 徐志远 魏申誉 莫少伟 吕航 程向东

作者单位： 310053 浙江中医药大学第一临床医学院（施成炜 魏申誉 莫少伟）

310022 浙江省肿瘤医院（徐志远 程向东）

310006 浙江省消化系统肿瘤中西医结合诊治重点实验室（吕航）

近年来，肿瘤免疫治疗的出现给人类“攻克”肿瘤带来了新的希望。免疫治疗能够通过抗肿瘤的免疫反应提高患者对化疗的敏感性，而化疗更能通过增强肿瘤细胞的免疫原性及对免疫杀伤的敏感性，促进抗原交叉提呈和抗肿瘤效应。然而，目前大多数癌症患者并未从免疫治疗中受益。免疫治疗依赖于免疫支持性肿瘤微环境（TME）内免疫效应细胞的积聚和活性。有研究表明，大多数实体肿瘤产生免疫逃逸与血管异常有关，而肿瘤血管的异常是血管生成因子（VEGF）和促血管生成素2（ANG 2）水平升高所致。抗血管生成因子靶向药物的使用可以使结构异常的肿瘤血管正常化，将内在的免疫抑制性TME转化为免疫支持性TME，从而促进免疫效应细胞对肿瘤的杀伤作用。因此，联合应用抗血管生成治疗和免疫治疗可以提高免疫治疗的有效性，降低免疫相关不良反应的风险。本文就肿瘤血管生成与免疫细胞的相互作用进行分析，以期为抗肿瘤血管生成联合免疫治疗在抗肿瘤治疗中提供借鉴。

1 异常的血管生成促进肿瘤进展

肿瘤的发生和发展得益于血管的招募。肿瘤血管不仅运输氧气和营养物质，而且为肿瘤细胞转移扩散和免疫细胞浸润提供通道［1］。相对于良性组织，肿瘤的血管在结构和功能上均是异常的。血管异常化通过灌注损伤导致肿瘤环境的低氧和低pH值，从而促进肿瘤的进展，因为肿瘤细胞可以适应这些环境条件，并且比正常细胞具有更好的生存优势。血管异常和灌注受损也会限制细胞毒性药物和免疫细胞从体循环进入肿瘤，从而使肿瘤逃避免疫。异常的TME可以降低药物和免疫细胞在肿瘤中的活性。肿瘤血管异常化和TME的形成所带来的不良后果还包括炎症、纤维化、基因组不稳定、DNA甲基化、向无氧代谢的转变、对自噬和凋亡的抵抗、诱导肿瘤干细胞程序、上皮-间质转化以及肿瘤细胞的侵袭和转移［2］。在下面的章节中，作者详细阐述了血管生成因子在介导免疫抑制和肿瘤转移中的作用。

1.1 VEGF在免疫抑制中的作用 在各种血管生成因子中，VEGF在TME中具有不同的活性，在肿瘤模型中，VEGF在局部和全身免疫抑制中的作用得到了广泛的研究［3-4］。TME中水平过高的VEGF至少通过四种不同的机制诱导肿瘤相关免疫抑制。首先，VEGF的增加直接抑制细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的增殖、转运和免疫应答功能。Voron T等［5］研究证明肿瘤微环境中产生的VEGF可以增加CD8+T细胞上PD-1以及其他抑制性检查点的表达，从而抑制T细胞的免疫功能；第二，VEGF抑制树突状细胞（DC）成熟和抗原提呈，从而阻碍T细胞活化，进而抑制T细胞介导的抗肿瘤免疫应答。Gabrilovich等［6］研究表明在机体内，VEGF达到病理浓度后会对多能干细胞产生影响，进一步抑制DC的分化，同时影响造血干细胞其他种系的分化；第三，高水平的VEGF促进免疫抑制细胞的募集和增殖，包括Treg细胞、MDSCs和M2型TAMs；第四，VEGF能促进血管生成，导致肿瘤血管畸形，造成TME中缺氧和低pH，从而促进局部和系统性免疫抑制。

1.2 Ang 2在免疫抑制中的作用 与VEGF比较，ANG 2作为血管生成的另一个关键调节因子，其免疫调节作用尚不清楚。然而有研究表明激活的ANG 2信号可通过多种机制促进肿瘤的免疫抑制。首先，ANG 2通过上调粘附分子来增加白细胞-内皮细胞的相互作用，从而促进MDSC、Treg细胞和表达TIE2的单核细胞（TEMs）的聚集，诱导免疫抑制。Scholz等［7］研究发现ANG2可以通过旁分泌的方式调节β2-整合素，进而调节髓系细胞的浸润。Coffelt等［8］研究表明ANG2可以刺激TEMs分泌IL-10，而IL-10可以抑制T细胞的增值，增加CD4+/CD8+T细胞的比例，扩大Treg细胞的数量。其次，ANG 2可以干扰内皮细胞-周细胞的相互连接，从而促进免疫细胞从血管内向TME 迁移。Holopainen T等［9］研究发现阻断ANG2信号通路后，可以保持内皮细胞之间的完整性并促进细胞之间的连接，从而抑制肿瘤的转移与扩散。最后，ANG 2还通过抑制肿瘤坏死因子（TNF）的分泌来调节单核细胞的功能，从而限制单核细胞的抗癌活性。此外，单核细胞溢出血管后通常分化为巨噬细胞聚集在炎症性和恶性组织中，而组织低氧状态会促进ANG2的表达，进一步增加ANG2对单核-巨噬细胞的抑制状态。

2 免疫细胞促进血管生成

肿瘤相关的巨噬细胞（TAM）和中性粒细胞（TAN）通常可以表现为两类特征，一类表现为抑制血管增生以及免疫支持，另一类则表现为促血管生成和免疫抑制，但是在肿瘤中这些细胞通常被分化成免疫抑制和血管生成表型。有研究表明肿瘤微环境中的TGF-β可以诱导促肿瘤生长表型的TAN生成，抑制TGF-β后可以使促肿瘤生长表型的TAN转化为抗肿瘤表型的TAN。此外，还有研究发现具有单核或颗粒形态的未成熟GR1细胞在肿瘤中具有促进免疫抑制的功能，因此也被称为髓系抑制性细胞（M-MDSC和G-MDSC）［10］。在血管形成过程中，参与了多种髓样细胞分泌的血管生成介质，包括生长因子和细胞因子。在多种动物肿瘤模型中，已有大量证据证明了髓系细胞在肿瘤血管生成及肿瘤的发生、发展和转移过程中起着重要的作用［11］。

2.1 TAM在血管生成中的作用 TAM占肿瘤微环境中细胞的30%，常与肿瘤血管密度增加有关［12］。Lin EY等［11］在小鼠内源性乳腺病毒瘤肿瘤模型中，首次发现TAMs及其VEGF在肿瘤血管生成中具有重要作用。通过阻断巨噬细胞上的csf 1-csf1r信号通路，或者使巨噬细胞特异性缺失VEGF，甚至通过罗膦酸脂质体广泛消耗TAMs，结果都可以延缓血管的生成。Stockmann等［13］在多个皮下同种异体移植模型和PyMT肿瘤模型中，观察到髓系来源的VEGF足以增加这些肿瘤对细胞毒性化疗药物的敏感性，而且敲除肿瘤内TAMs中的VEGF后能增强肿瘤对机体的适应性，促进肿瘤细胞的生长。因此，只要将血管生成减至一定水平，即可产生更多功能正常的血管，并增加周细胞覆盖率，从而减少瘤内缺氧，促进肿瘤细胞凋亡。

表达血管生成素受体Ti2（TEK）的单核细胞（TEMs）是巨噬细胞的子集，这些单核细胞通常通过内皮细胞分泌的Tie 2配体Ang-2与血管生成密切相关。在乳腺、胰腺神经内分泌和脑肿瘤模型系统中，通过选择性去除TEM上Tie 2启动子驱动的胸苷激酶表达，或用Ang2抑制剂证明了它们与肿瘤血管生成相关性［14-15］。TEMs不仅在肿瘤进展过程中刺激了新生血管，而且对化疗和放疗也有反应，Russell 等研究发现经过化疗后，一种M2亚型的巨噬细胞会聚集在肿瘤血管周围，其会促进肿瘤的复发［16］。值得注意的是，这些单核细胞中Tie 2的基因缺失可以破坏其特异的血管旁定位和促血管生成的能力［15］。通过巨噬细胞中Tie 2基因的缺失来模拟肿瘤内皮细胞中Ang2缺失的作用，进一步证明了Ang2-Tie2轴是TAMs与内皮细胞之间促进新生血管的关键信号节点［15］。TAMs还可以表达神经和血管引导分子，用来调节细胞的生长与转移。其中Semghin3A（Sema3A）正如肿瘤缺氧诱导的Ang2一样，通过介导PlexinA 1/PlexinA 4/VEGFR 1复合物的NRP-1依赖性信号，促进巨噬细胞的募集和诱导血管生成。被这些分子激活后，TAMs迁移至低氧区，分泌各种免疫抑制因子和促血管生成因子。然而，一旦TAMs处于低氧环境中，Nrp-1的表达就被HIF2α介导的NFkB激活通路所抑制，TAMs对Sema3A的迁移反应终止，使这些巨噬细胞滞留在缺氧区。同样地，Andrea 通过实验也证明了TAMs中NRP-1的丢失可以阻止其向低氧区的浸润，进一步转变缺氧诱导的免疫抑制状态、破坏了新生血管生成，从而延缓胰腺、肺癌、乳腺癌模型的肿瘤生长和转移。Miyauchi在一种实验性胶质瘤模型中也有类似的发现，浸润的巨噬细胞和小胶质细胞中Nrp-1基因的缺失后，通过将细胞重新分化成免疫支持表型来发挥作用而表现出抗肿瘤效应［17］。

2.2 TAN和MDSC在血管生成中的作用 与血管生成有关的其他主要髓样细胞类型是中性粒细胞、颗粒细胞，它们是白细胞中最丰富也是最先被招募至损伤处的细胞。中性粒细胞在防御病原体入侵中发挥着关键作用，它们具有吞噬微生物、从颗粒中释放可溶性抗微生物分子、生成中性粒细胞胞外杀菌网络（NETs）等功能。在肿瘤和转移瘤中，中性粒细胞分泌与巨噬细胞中相似的促血管生成因子和蛋白酶，主要为VEGF、FGF和MMPs。其中Gaudry M等［18］发现中性粒细胞可以携带增强VEGF的颗粒，这些颗粒在接受TNF刺激后释放因子，并能快速激活VEGF信号通路以促进血管生长。

肿瘤也会招募骨髓来源的免疫抑制细胞（MDSC），未成熟的髓系细胞可分为粒细胞（G-MDSC）和单核细胞（M-MDSC），不仅具有免疫抑制作用，而且还具有血管生成特性。Movahedi K等［19］首次研究发现MDSC能抑制人CD3和小鼠CD4或CD8 T细胞的能力，并认为MDSC的分化程序在不同的肿瘤中是有差异的。Ae Dirkx等［20］发现MDSC产生的VEGF足以抑制肿瘤相关内皮细胞粘附分子ICAM-1和VCAM 1的表达，从而限制T细胞的粘附和外渗。同时肿瘤中也有G-CSF、IL-1β和IL-6等多种因子通过STAT 3途径激活和扩增MDSCs，促进肿瘤血管的生成，同时阻断其向中性粒细胞或巨噬细胞的分化。

2.3 淋巴细胞调节血管生成 淋巴细胞在肿瘤血管生成中的作用尚未见报道，但最近的研究表明淋巴细胞具有直接或间接调节血管生长的能力［21-22］。此外，不同的T细胞类型对肿瘤血管生成有负性或正调节作用。CD8+T细胞和CD4+Th1细胞产生IFNγ，抑制内皮细胞增殖，并诱导TAMs中血管抑制因子CXCL 9、CXCL 10和CXCL 11的产生［23］。然而，Treg细胞在缺氧条件下产生的CCL 28促进自身分泌VEGF和抑制CD4 Th1细胞分泌INFγ，这两者均参与了肿瘤环境中的血管生成。Tian L等［24］研究证明了肿瘤内CD4和CD8 T细胞耗竭后会加速肿瘤血管功能失调以及导致缺氧增加，而CD8+T细胞内流和通过检查点免疫治疗（抗PD1和/或抗CTLA 4）或过继TH1的治疗可使肿瘤血管正常化，减少缺氧和肿瘤转移。

3 抗血管生成治疗促进免疫治疗

免疫治疗的成功取决于免疫细胞（尤其是CTL）在TME中的募集、扩增，从而产生免疫应答。T细胞的聚集是一个多步骤的过程。首先，T细胞必须与血管内皮细胞表面的粘附分子（如E-选择素、ICAM-1和VCAM 1）相互作用，然后穿过内皮屏障进入肿瘤发挥免疫作用。Schmittnaegel M等［25］在实验中发现双重抗VEGF-ANG2治疗可上调血管内皮细胞中粘附分子的表达，从而促进多种类型肿瘤模型中CTL的外渗和血管周围聚集，由此可见双抗VEGF-ANG2治疗是部分呈CTL依赖性的，而血管周围T细胞的增多又同时上调了肿瘤内皮细胞中的PD-L1表达，这也是抗血管生成治疗联合免疫治疗的理论基础。此外，免疫检查点抑制剂（ICBS）有时会引起严重的免疫相关的不良事件，这些毒性反应通常可以通过停止ICB治疗或减少免疫检查抑制剂的剂量来得到缓解。而肿瘤血管正常化可以改善治疗药物对肿瘤的传递［2］。因此，联合治疗后可降低免疫检查点抑制剂的使用剂量，从而降低免疫治疗的毒性风险，提高患者生活质量及预后。

4 免疫治疗促进抗血管生成治疗

抗血管生成治疗目前在临床上应用较多，但是目前只有部分患者可以获益，并且治疗效果与肿瘤类型密切相关，还受到了多种肿瘤复发机制的限制。Allen E等［26］在胰腺癌，乳腺癌及脑肿瘤的模型中观察到，在应用抗血管生成治疗后，肿瘤内PD-L1的表达会上升，诱导了免疫抑制途径，从而使PD-L 1与活化T细胞表面的PD-1结合诱发免疫抑制，导致T细胞失能或衰竭。在联合应用抗VEGFR2和抗PD-L1治疗后，成功诱导了乳腺癌和胰腺神经内分泌肿瘤中肿瘤高内皮微静脉（HEVs）的产生，但是对胶质母细胞瘤无任何影响。这些HEVs可以激活淋巴细胞毒素β受体（LTβR）信号，提高淋巴细胞在肿瘤内的浸润和活性，通过临床前研究证明了抗Pd-L1治疗可以使肿瘤对抗血管生成治疗敏感，并延长其疗效，同样地，当抗PD-L1治疗后产生了有助于增强CTL浸润、活性和破坏肿瘤细胞的HEVs时，抗血管生成疗法可以改善抗PD-L1治疗。但是联合抗血管生成治疗和抗PD-L1抗体并不能改善胶质母细胞瘤模型的存活率，这种缺乏疗效的原因是胶质母细胞瘤内HEVs的发生率较低［26］，这也给我们在解决联合治疗的疗效问题时提供了新的入手点。由此可见，应用可诱导HEVs形成和/或增加抗原负荷的治疗，包括放射、化疗和癌症疫苗，可能会提高ICB联合抗血管生成治疗的疗效。

Tian L等［27］发现，在乳腺癌模型中应用CTLA-4和PD-1抑制剂可以使肿瘤血管正常化，这一过程包括增加血管周细胞覆盖，改善肿瘤血管灌注，降低血管通透性，减轻缺氧，从而抑制肿瘤的进展。研究中观察到的血管正常化效应是由于CD4+Th1细胞聚集增加和抗癌活性增加所致。该实验研究仅限于乳腺癌模型，ICB介导的血管正常化是否在多种肿瘤类型中被诱导还有待确定，但是揭示了Th1细胞可能是免疫检查点阻断和抗血管生成效应的标志和决定因素，也为两种治疗方法的联合应用提供了新的理论基础。

5 结语与展望

目前，各种血管生成抑制剂的联合治疗方式，尤其是针对VEGF-R和Ang2-TIE轴的联合治疗方法，以及免疫检查点抑制剂和其他免疫治疗方法，在临床上得到了评价。免疫检查点抑制剂已经成为癌症治疗的一个里程碑。然而，ICB虽然可以显著延长部分患者的存活时间，但通常无法改善其余大多数患者的预后，并且存在较大的副作用。抗血管生成药物只能提高几个星期至几个月的少量生存获益，并且容易产生耐药。因此，将这两种治疗方法联合起来可能具有改善患者预后，降低副反应的潜力。

目前，靶向VEGF途径的药物的剂量是一个关键的考虑因素。高剂量和/或长时间的抗VEGF治疗与肿瘤灌注水平降低和缺氧加重有关［12］。靶向抑制ANG2-TIE2药物对VEGF通路的阻断虽然延长了血管正常化的窗口，并将免疫抑制的微环境转化为免疫刺激分子，但是随着时间的推移，肿瘤微环境再次缺氧，并通过在TME的肿瘤细胞和基质细胞（包括ECs和免疫细胞）上调PD-L1来避免这一联合治疗途径。因此，迫切需要优化与icb联合使用的抗血管生成药物的剂量、持续时间和给药顺序，来为临床应用做出更好的指导。此外，也有研究证明了ARBs类药物可以减少肿瘤的基质胶原和透明质酸的产生，从而减少血管压力，改善血流灌注，达到加强化疗疗效的目的［28］。因此，将ARBs与抗血管生成药物和免疫检查点抑制剂进行联合试验也具有广阔的治疗潜力。

针对抗血管生成治疗联合免疫治疗的许多临床试验也正在进行中，第一项随机研究试验（NCT 01984242）也已发表，并评价了在肾细胞癌（MRCC）患者中，抗PD-L1（Atezolizumab）联合贝伐单抗与标准治疗方案苏尼替尼比较效果更好［29］。这些临床试验结果符合临床前研究，也进一步证实了抗血管生成治疗联合肿瘤免疫治疗的科学性和有效性，更期待之后陆续的临床试验结果。