幽门螺杆菌生物膜的形成 致病性及其耐药性

周杰挺 谷海瀛

作者单位：315211 宁波大学医学院

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是一种革兰氏阴性，微需氧的人类病原体，目前已证实Hp感染与多种胃十二指肠慢性疾病密切相关，包括慢性活动性胃炎，消化性溃疡，萎缩性胃炎，黏膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤和胃癌。据报道，世界上超过一半的人口受Hp感染，在发展中国家年龄＞50岁的人群中Hp感染率高达80%［1］，这给公众健康带来了巨大的负担。自20世纪80年代发现Hp以来，对于Hp的研究主要集中在浮游态和非附着的生长方式上；然而，越来越多的证据表明Hp可以以一种被称为生物膜的表面附着方式呈群落生长，这种生长模式有助于病原微生物在恶劣环境中的存活及抵抗抗生素的干预治疗和宿主免疫系统的反应，从而延长感染时间，导致慢性感染［2］。目前，关于Hp生物膜的研究仍处于早期阶段，其形成及其在致病中发挥的作用尚不明确，因此，本篇综述将介绍近年来关于Hp生物膜形成相关分子机制及其生物膜致病作用的最新研究进展。

1 胃部幽门螺杆菌生物膜的形成

2006年，Carron等［3］使用扫描电子显微镜（SEM）首次观察到致密成熟的Hp生物膜存在并附着于人胃黏膜活检标本的上皮细胞上。近年来，Attaran B等［4］在小鼠模型中也证实了Hp生物膜的形成。他们使用SEM和多克隆抗Hp特异性免疫荧光抗体观察到Hp在小鼠胃黏膜上形成了生物膜，表现出与在人类胃黏膜上一样的潜力，由无定型细胞外基质包裹的球形细菌牢固地附着在上皮细胞上。而且Cammarota等［5］报道，对于有≥4次Hp根除失败病史的患者中，胃活检标本的SEM分析显示Hp在所有患者的胃黏膜上形成生物膜，并且当Hp被根除时，所有患者的生物膜都消失了。目前，尚不清楚体内生物膜基质是由细菌自己产生的，还是宿主衍生的基质（例如胶原、层粘连蛋白和纤连蛋白）抑或两者兼而有之。需要进一步的研究来确定宿主细胞对生物膜细胞外基质的作用。Hp除了可在胃黏膜上皮细胞表面定植，还可以在胃肠道的腺体中定植［6］。这些腺体为Hp提供了一个良好的生长保护性环境。在Hp感染2～4周后，约有50%的腺体受到侵犯，达到平均25～40个细菌/腺体的腺体密度，在慢性感染中也有约10%的腺体受到侵犯。然而，在胃腺体中发现的Hp聚集体与生物膜中的生长方式相似，这可能是导致慢性感染的一个原因。因此，深入研究Hp生物膜生长方式在定植和持久性感染中的潜在作用是有必要的。

2 幽门螺杆菌生物膜形成相关的分子机制

观察到Hp具有形成生物膜的能力至今已有20年了，近年来越来越多的研究开始聚焦于其生物膜形成的分子机制，多种方法学如蛋白质组学、基因组学、转录组学被应用于探索这种分子机制。

Shao C等［7］通过模拟营养缺乏的生存压力环境，诱导Hp生物膜的产生，通过高分辨率二维凝胶电泳获得浮游态Hp和早期生物膜中Hp的蛋白质组谱，随后应用串联基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionzation time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-TOF MS）鉴定两者的差异蛋白质斑点，最终鉴定出了35种与Hp早期生物膜形成关系密切的蛋白质。这些蛋白质与多种生物学功能相关，包括鞭毛运动、细菌毒力、信号转导和调节。Feng-Ling Yang等［8］比较了第4天和第7天Hp生物膜的蛋白质谱与第4天和第7天的浮游态培养物的蛋白质谱，发现中性粒细胞活化蛋白A（NapA）与其他9种压力诱导的蛋白（包括60-kDa伴侣蛋白、过氧化氢酶、柠檬酸合成酶等）在生物膜中表达显著增加，同时他们构建了NapA缺失突变的菌株，观察发现相比于同基因的野生型菌株，突变株的生物膜产生量减少且细菌聚集也明显减少。

在基因层面，目前研究发现与Hp生物膜形成可能相关的基因较多且复杂，Wong EH等［9］使用结晶紫法测定了32株（1株标准菌株和31株临床菌株）Hp的生物膜产量，按照生物膜的量分为少量、中等和大量三个组，之后通过对32株菌株进行全基因组测序并将基因序列进行比较后发现三种假设基因K74_10375、K747_09130、K747_06625以及fucT、jhp_1117、homD 和cagA基因与生物膜形成的相关性最大。前三种基因的产物尚不明确，后四种基因编码的产物分别为α-（1，3）-岩藻糖基转移酶、鞭毛蛋白、外膜蛋白和细胞毒素相关基因致病岛（cagPAI）蛋白。从功能上来看，这些基因所编码的产物在功能上与Shao C等研究发现的与Hp生物膜形成相关蛋白的功能类似。CagA基因的高表达似乎不难理解，因为普遍认为CagA 阳性的菌株致病力较强，这种较强的毒力可能与生物膜的形成存在联系。而鞭毛在生物膜形成中的作用同样值得重视，Wong等［9］在对Hp体外生物膜的研究中发现生物膜的形成依赖于鞭毛的作用，这与鞭毛能够促进细菌聚集及参与外膜囊泡形成相关。另一项研究通过转录组学序列分析发现，在Hp生物膜上调基因中包含了与鞭毛装置形成有关的基因，进一步证实了鞭毛结构在Hp生物膜形成中的关键作用。此外，这项研究还发现生物膜下调的基因主要是参与代谢和翻译的基因，而与生物膜产量上调相关基因的产物主要在细胞膜上，主要是一些参与应激反应的基因。表明生物膜中细菌的代谢活性较低，且生物膜的形成是一种应激反应［11］。

3 幽门螺杆菌生物膜与抗生素耐药的相关性

目前，对于Hp感染的一线治疗，克拉霉素（clarithromycin，CAM）耐药性是一个日益严重的问题，CAM抗性临床菌株的分离率约为10%～30%。据报道，Hp 23S rRNA基因结构域V环中的点突变是产生克拉霉素耐药性的基础［12］。然而近年来，研究发现Hp生物膜与抗生素耐药性可能也存在相关性，相比于浮游态的细胞，生物膜细胞对抗生素的抵抗力可增加100～1000倍［13］。目前，已经提出了多种生物膜增加抗生素耐药性的可能机制：（1）由于细胞外基质的物理屏障作用抗生素未能渗透生物膜；（2）由于生物膜内营养限制而导致生物膜细胞生长缓慢；（3）生物膜内细菌在多种压力条件下增加了突变的频率以及抗生素耐药菌株的产生；（4）生物膜内细菌通过基因水平转移，整合接合元件和自然转化增加了抗生素抗性的传播［14］。尽管Hp生物膜形成对抗生素耐药性的影响尚未得到充分证实，已有研究发现Hp生物膜的形成与克拉霉素耐药存在相关性。Yonezawa H等［15］在研究中发现，在CAM的最小抑菌浓度（MIC）水平上，Hp成熟（3d）生物膜相比于中间体（2d）生物膜明显增加（由0.03增加至0.5μg/ml）；在最小杀菌浓度水平上，生物膜细菌（1.0μg/ml）比浮游态细菌（0.25μg/ml）明显增加。而且其发现在经过最低抑菌浓度的CAM处理后，Hp培养物生物膜的产量相比于非处理组增加了4倍（2d生物膜）和16倍（3d生物膜）。另一项研究发现，Hp1174（葡萄糖/半乳糖转运蛋白），这种主要促进子超家族（major facilitator superfamily，MFS）的外排泵在生物膜形成和多重耐药Hp菌株中高度表达，提示外排泵在Hp生物膜抗生素耐药性增加中起到一定的作用［16］。

4 幽门螺杆菌生物膜与免疫逃逸的相关性

Hp在感染时可引起宿主上皮细胞的促炎反应，导致免疫细胞的募集，表现为胃炎，尽管有强烈的免疫反应，但其仍可在体内持续存在并最终导致慢性胃炎。然而目前关于Hp如何在免疫系统的攻击下存活依然了解较少，生物膜的形成被认为可能是一种躲避宿主免疫攻击的有效机制。生物膜保护细菌免受宿主的适应性免疫反应以及吞噬细胞的吞噬。生物膜还可以为细菌的水平基因转移（HGT）提供一个理想的环境，这有助于产生一系列具有不同抗原与毒力特征的相关细菌，最终将为细菌提供混淆和压倒宿主免疫系统的手段［17］。有研究发现感染者对Hp的记忆性CD4+T细胞应答受损，这与Hp特异性调节T细胞并主动抑制其应答相关［18］，而这种抑制可能与Hp生物膜细胞外基质中的蛋白多糖介导的免疫调节有关。另外，有研究表明应用钙卫蛋白（calprotectin，CP）处理Hp培养物可改变细菌外膜脂质A结构，进而降低细菌表面的疏水性并增加生物膜的形成。CP是一种重要的抗菌因子，是营养免疫营养扣留过程的关键组分［19］。为了防止病原微生物感染，人类和其他哺乳动物通过营养免疫限制其获取必需金属［20］。很明显，宿主的营养限制和细菌的营养获取是传染病发病机制中的关键过程。CP以高亲和力结合Mn和Zn，限制这些必需金属的传递，从而形成Mn和Zn限制的隔离环境。而Hp拥有通过改变外膜结构促进生物膜形成来规避CP抗菌活性的能力［21］。

5 总结

综上所述，Hp生物膜的形成在感染过程中具有不可忽视的作用。相比于浮游态的细菌，对Hp生物膜的研究似乎更贴近于其对人体致病过程的真实情况。在今后的研究中，应鼓励研究者创建接近体内环境的生物膜体外模型。事实上，生物膜不仅可以存在于胃部，还可以存在于环境中，已有研究证实水源是Hp感染的一个重要来源，研究者通过多种分子学手段在河水中检测到了Hp的DNA，尽管目前并无证据表明Hp可以在水源中形成生物膜，但其可能嵌入其他细菌形成的生物膜中，并在其中存活［22］。另有研究表明Hp可通过在蔬菜上形成生物膜来延长其存活期［23］。因此，生物膜的形成可能是Hp在胃外环境中重要的传播方式。另一方面，随着CAM耐药率的提高，根除失败率也日益增高，然而，目前，普遍依然使用浮游细胞评估Hp菌株对体外抗生素的敏感性，但体外MIC并非人胃中抗生素效应的可靠预测因子，所以，作者认为对Hp生物膜形成能力的评估可以在预防和控制抗生素耐药上发挥重要作用。此外，需要更多的研究进一步探索Hp生物膜的致病机制，针对其形成和在致病过程中的关键环节开发新的预防治疗策略，为提高根除效率提供新的方案。