外泌体在心肌缺血及房颤诊治中的应用前景研究进展

2020-12-20倪瀚文吴立群

诊断学(理论与实践) 2020年2期

倪瀚文，吴立群

（上海交通大学医学院附属瑞金医院心脏内科，上海 200025）

外泌体是细胞外囊泡的一种亚群，其包含了大量的生物活性物质，在细胞信号转导过程中发挥着重要作用，如信号在不同细胞之间进行转导能维持组织内环境恒定以及作出应激反应。心血管系统作为一个复杂的、由多种细胞组成的系统，外泌体在心肌细胞间充当信号转导分子。前期外泌体相关研究较多集中于肿瘤的发病机制、诊断及治疗，而近年外泌体在心血管系统中的作用越来越受到重视。目前，关于外泌体在心血管疾病中的研究已获得了较多进展，尤其在诊断和治疗方面进展突出，提示外泌体可能是今后治疗心血管疾病的潜在方向。心肌缺血及心房颤动（atrial fibrillation，AF）是临床常见的心血管疾病，近年关于外泌体在其诊治中的应用研究进展较快，本文将就当前的相关研究热点作一综述。

外泌体的组成及生理作用

一、外泌体的成分及来源

外泌体作为细胞外囊泡的一种，其直径为30～150 nm，可由不同类型的细胞释放[1]。外泌体可以在血浆、血清、唾液、羊水、母乳和尿液等多种体液中存在，而其在体外细胞培养液中也同样存在。外泌体富含各种生物活性物质，包括DNA、mRNA、微小RNA（microRNA,miRNA）、长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）和蛋白质，当这些生物活性物质随外泌体一起被转运的时候，外泌体及其包裹的活性物质成为了细胞间的信号转导物质。

外泌体来自于内涵体内吞形成的多囊泡体，随后多囊泡体与细胞膜融合后被分泌至细胞外[2]。外泌体内的组成成分依赖于所来源的细胞类型，同时这些成分也很在大程度上反映了来源细胞的生理和病理状态，提示外泌体的分泌、包含物及功能与其来源的细胞微环境改变密切相关。目前，尚不清楚外泌体是如何选择其包含物组成成分的，但这些组成成分相对固定，即使被分泌到细胞外，也不会降解。

二、外泌体的生理作用

外泌体除了进入邻近的靶细胞外，还可以随着体液进入较远区域的靶细胞；外泌体依据自身的细胞来源、靶细胞特点、环境特点，可通过内吞、膜的融合、配体受体结合等方式，识别靶细胞并进入靶细胞[3-4]。因此，外泌体可作为一个在不同生理、病理机制下的信号转导物、诊断标志物以及潜在的治疗靶点，已成为一个新的研究方向。

心血管系统作为一个多种细胞组成的组织，外泌体可以在不同的细胞间进行信号转导，以维持正常心血管生理状态的稳定，但外泌体同时也在一系列的心血管生理、病理过程中起着重要作用[4]。研究提示，外泌体不仅参与多种心血管生理、病理过程，且比细胞具有更显著的稳定性、生物相容性和非免疫原性。外泌体具有在低温保存过程中不容易降解等特点，使其成为一个比全细胞治疗更有效的、全新的诊断和治疗方向[5]。

外泌体在心血管疾病状态下的变化及其在诊断中的应用

心脏各细胞释放外泌体至体液中，因此外泌体具备了作为心脏疾病生物学标志物的可能性。心血管疾病患者外周血循环中的外泌体有2 种来源，其一是来自于心脏各细胞，另外是来自于疾病情况下全身各细胞释放的外泌体。目前，这2 种外泌体在外周血中尚不能被区分，但在不同的心血管疾病状态下，其表达的数量和所包含的成分都会不同，可作为疾病变化的标志物进行研究。研究发现，在心血管疾病状态下，尤其是应激情况下，如在衰老和内质网应激时，外周血外泌体的数量会增加，但目前其机制尚未明确[6]。

来自不同心脏细胞的外泌体，其包含物的作用主要是参与调节心脏细胞的功能。心脏大部分由心肌细胞组成，其他的非心肌细胞包括心肌成纤维细胞、连接心肌细胞和成纤维细胞的心肌内皮细胞，其中内皮细胞在维持心脏内环境恒定中起重要作用。外泌体作为信号转导物质在心肌细胞、心肌成纤维细胞以及内皮细胞之间进行信息传递。

一、来自心肌细胞的外泌体

1.蛋白质组学：在动物模型的研究中发现，心肌细胞能够释放外泌体，且在缺氧刺激后，外泌体释放增加，其标志性包含物热休克蛋白60（heat shock protein 60,HSP60）在应激的条件下增加。研究对缺氧刺激下由心肌细胞产生的外泌体进行了蛋白质组学分析，发现其蛋白质组成成分与生理条件下相同，但其蛋白质的量发生了改变。在这个蛋白质组中包括了HSP60、原肌球蛋白α、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、球蛋白、肌球蛋白结合蛋白C、含缬酪肽蛋白以及HSP27、HSP90[7]。其他研究表明，缺氧刺激会导致细胞凋亡的发生，因此，凋亡相关的肿瘤坏死因子α 同样会出现在心肌细胞外泌体中[8]。

2.miRNA：在各种心血管疾病条件下，除外泌体中蛋白质组学的改变外，miRNA-30a、miR-21-5p、miR-378-3p、miR-152-3p 等也有非常显著的改变[9]。有实验表明，心肌细胞分泌的外泌体可被心肌成纤维细胞或内皮细胞内吞，从而改变成纤维细胞和内皮细胞的生物学行为[10]。例如，心肌细胞分泌的外泌体中的DNA 可出现在成纤维细胞中，促进成纤维细胞的基因表达[11]。心肌纤维化是心肌细胞受到长期损伤导致心脏功能受损的原因之一。动物实验表明，心肌细胞分泌的外泌体中所包含的miR-217 被成纤维细胞所吞噬，可加速心肌纤维化[10]。

二、来自心肌成纤维细胞的外泌体

心肌成纤维细胞与细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的转变有关，心肌成纤维细胞的分泌特性可以影响心肌其他细胞的生理活性。心肌成纤维细胞外泌体蛋白质组学的动物模型研究表明，在缺氧条件下，蛋白质的组成和数量都有改变，尤其会出现与ECM 有关的蛋白质改变，包括多种类型的胶原蛋白、基底膜蛋白多糖及纤维连接蛋白等；同时也伴有线粒体蛋白的改变[12]。

心肌成纤维细胞分泌的外泌体中同样包含了miRNA。大鼠实验研究表明，心肌成纤维细胞分泌的外泌体富含rnomiR-21*，而外泌体将rno-miR-21* 转运到心肌细胞，可导致心肌细胞肥大[12]。研究显示，心肌成纤维细胞分泌的外泌体是连接心肌成纤维细胞与心肌细胞之间的重要桥梁。

三、来自内皮细胞的外泌体

心脏微血管系统是维持心脏健康和心脏组织恒定的重要因素，心脏内皮细胞是血管与组织周围之间的内皮屏障，尤其在炎症、缺氧等应激状态下，内皮细胞在维持心脏组织功能恒定中起着重要作用，其不仅释放了生长因子、细胞因子，还释放了外泌体以介导细胞间的信号转导[13]。

四、临床诊断应用

1.外泌体中的miRNA：外周血外泌体中包含的miRNA、lncRNA、蛋白质等在心血管疾病的研究中都有所报道。外周血外泌体中的miRNA 是心血管疾病主要的研究对象，在不同病理状态下，外泌体中包含物miRNA 的量会发生改变，提示其可作为诊断心血管疾病的标志物。例如，血清外泌体hsa-miR-1、hsa-miR-133a 在急性冠脉综合征（acute coronary syndrome,ACS）中会升高。在急症中，ACS 需要与急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AMI）区别，经典的AMI 诊断标志物是肌钙蛋白和肌酸激酶MB，肌钙蛋白的峰值在心肌损伤后12 h 达到最高峰，且其水平与梗死面积成正比。相关研究发现，血浆外泌体中包含的miRNA 会在AMI 患者中出现，而且它们要比肌钙蛋白更早达到峰值，其中hsa-miR-192、hsa-miR-194 以及hsa-miR-34a 存在外周血的外泌体中，在AMI 伴有1 年内心力衰竭患者的血清中升高，提示其可能是潜在的诊断标志物[14]。在风湿性心脏病患者外周血的外泌体中，miRNA 及lncRNA 的表达发生变化，研究进一步鉴定发现，其中5个相关的lncRNA 发生改变，且对应的基因与风湿性心脏疾病发生间有密切的关系[15]。

2.外泌体中的蛋白质：关于心血管疾病外周血外泌体蛋白质组学的分析鲜见报道，只有Cheow 等[16]鉴定了一些新的蛋白质可以作为心肌损伤的标志物，这些蛋白质分别属于补体系统（C1Q1A、C5）、脂蛋白代谢 [载脂蛋白D（apolipoprotein D，ApoD）和载脂蛋白C3（apolipoprotein C3，ApoC3）]以及血小板激活途径（血小板膜糖蛋白Ⅰb α 多肽和前血小板碱性蛋白）。

这些心血管疾病外周血外泌体的研究成果，无论是外周血外泌体数量的改变，还是外泌体包含物的改变，都是发掘潜在生物学标志物的基础。这些发现可应用于心脏疾病的个体化诊断和预后检测，是目前心血管疾病外泌体研究中一个比较可行的方向。

外泌体在心肌缺血及AF 诊治中的应用

外泌体作为一个治疗方法已经成为心血管疾病治疗的一个方向。外泌体具有的特点包括无免疫原性、非致瘤性、比细胞更稳定的生理活性、参与全身循环、可透过血脑屏障，更适合作为承载治疗成分的载体，且其比细胞更适合冻融、易于储存。这些特点使得外泌体成为疾病治疗的一个方向[5]，无论在肿瘤治疗或者心血管疾病的治疗中，相关研究成果日益增多[17]。无论是在体液循环中的外泌体，还是由心脏细胞释放的外泌体，都参与了心脏应对应激而产生的重塑过程。

从干细胞释放的外泌体历来被认为在心脏疾病中具有保护心肌细胞和促进再生的功能，因此利用干细胞体外培养液中收集的外泌体对心脏疾病进行治疗，已成为目前研究外泌体治疗方法的主流趋势。在研究干细胞治疗心脏疾病的实验中发现，外泌体具有与干细胞同样的治疗效果，由于采用干细胞治疗心脏疾病具有争议，如认为干细胞并不附着于心肌，因此，作为心脏细胞间信号转导物的外泌体，在心脏修复和重塑中可能起了更重要的作用。

最新的治疗研究成果显示，在阿霉素造成的心肌损伤中会伴随产生炎症性凋亡，而用干细胞、干细胞分泌的外泌体进行动物实验治疗后，干细胞和干细胞分泌的外泌体都可以提高抗炎症因子的表达，抑制细胞质空泡化、肌原纤维丢失、细胞肥大，最终达到提高心肌功能的目的[17]。由此可见，阿霉素诱导产生的心肌炎症性凋亡和心脏重塑可以被干细胞及干细胞分泌的外泌体所改善。

一、心肌缺血损伤

为了避免干细胞治疗相关的争议，有研究利用在外周循环中存在的外泌体对心血管疾病进行治疗，认为从各组织释放的循环外泌体对心脏也有重要的作用。在ST 段抬高性AMI 中的心肌细胞缺血再灌注过程中，循环细胞、细胞因子、微小囊泡和外泌体都起着重要作用。研究结果表明，血液循环中的微小囊泡和外泌体能够对缺血再灌注发挥有利的影响作用，其机制为外泌体包裹了miRNA 运输到心脏，减少了心肌细胞缺血再灌注的损伤[18]。由此可见，外周血循环外泌体中的miRNA 不仅可以作为一个诊断标志物，同时也可以作为一个有效的治疗方法，以非心肌细胞方式保护了心脏免受损伤及参与了修复过程。

关于外泌体注射入体内的方法，常见的是心肌内和冠状动脉内注射，而经比较发现，外泌体心肌注射比冠状动脉内注射更有效[19]。除了利用干细胞和外周循环产生的外泌体，还有实验利用人工的方法合成外泌体进行治疗，使得其外泌体具有一定的靶向性。有研究者设计了1个肽序列CSTSMLKAC，称为缺血心肌靶向肽，发现其对心脏缺血区域具有靶向性。Wang 等[20]人工设计了外泌体表面，使外泌体的内含物可以靶向释放到心肌组织中。体内实验发现，经缺血心肌靶向肽修饰的人工外泌体可以靶向治疗心肌缺血，使心脏功能得到显著改善。

外泌体在真正成为治疗心血管疾病方法之前，从实验室研究、动物实验过渡到临床应用还有很多研究工作要做，其中标准化分离、鉴定外泌体、外泌体中的成分、外泌体的靶向性等都是目前急需解决的问题。

二、AF

AF 是临床上最常见的慢性心律失常疾病，其发病与离子通道改变、电生理变化密切相关。钾离子通道相关基因的突变和异位兴奋灶的发生及其所导致的钾通道、钙通道异常[21]，通常被认为是AF 发生的主要原因，同时心房基质的改变、心房纤维化及心房扩大也与AF 的发生密切相关。尽管目前已有了多种假说，但关于AF 发生、发展的机制仍有待进一步研究[22]。

1.预测AF 的发生：最近研究表明，外泌体介导的心肌细胞间信号转导是心肌纤维化改变、心脏疾病发生的关键因素[12]。心肌纤维化在心脏修复中起到了关键作用。有研究发现，心肌细胞在缺血、缺氧情况下产生的外泌体促进了心肌的纤维化，损伤的上皮细胞分泌了富含促纤维化因子外泌体，导致纤维化的发生[23]。外泌体中包含的多种miRNA 被认为与调节成纤维细胞增殖、分化及纤维化形成密切相关[24]，包括miR-21、miR-425、miR-744、miR-208a 等。外泌体中包含的多种miRNA 也是心肌纤维化的标志物。在发生心肌缺血时，这些外周血外泌体中的miRNA 会比肌钙蛋白或者其他标志物更早出现[25]。尽管目前未有直接研究表明AF 中心肌纤维化与外泌体之间的关系，但由于AF 与心肌纤维化之间密切相关，这些研究结果为进一步研究AF 发生、发展的机制打下了基础。

2.评估AF 严重程度：在AF 研究中，有研究分析了外周循环外泌体在AF 患者中的水平以及可能的来源细胞器官。研究提示，AF 患者血循环中的外泌体量显著升高，如果伴随着血小板的激活和内皮的损伤，血小板来源的外泌体以及内皮细胞来源的外泌体量都会升高[26]。对AF 患者血清外泌体miRNA 进行研究，发现5 种miRNA（miRNA-103a、miRNA-107、miRNA-320d、miRNA-486、let-7b）在持续性AF患者中显著升高，提示这5 种miRNA 与心房的功能、结构、氧化应激以及纤维化有关，是潜在的监测AF 过程的生物学标志物[27]。同样，有研究比较了AF 患者与窦性心律对照者血浆外泌体中miRNA 的差异，结果发现血浆外泌体中miR-483-5p、miR-142-5p、miR-223-3p 与AF 相关，这可能是将来评估AF 严重程度、预后以及治疗方案选择的一个指标[28]。

基于AF 动物模型的研究发现，miRNA 在心肌凋亡、心肌纤维化生成中起重要作用，将诱导产生AF 后的动物模型心肌细胞进行培养，发现AF 发生后的心肌细胞与细胞凋亡、细胞活力降低密切相关，同时miR-320d 表达水平降低；而导入miR-320d 后，会使心肌细胞中的miR-320d、心肌细胞分泌的外泌体升高，逆转AF 导致的心肌损伤。因此，miR-320d 与AF 造成的心肌细胞凋亡及细胞活力降低密切相关，同时，其与外泌体的生成有关，miR-320d 在AF 动物模型中可诱导外泌体分泌的增加，这为将来尝试采用外泌体治疗AF 提供了一个新方向[29]。

外泌体中的lncRNA 也成为了AF 疾病中的研究对象。心外膜脂肪组织在AF 病理中充当了重要角色，有研究对心外膜脂肪组织的外泌体lncRNA 进行了分析，发现有57个lncRNA 发生了显著变化，这些lncRNA 与代谢过程及应激反应过程相关[29]。

在AF 的研究中，针对外周全血、血浆及外泌体中的线粒体DNA 进行了探讨，结果发现外周全血、血浆及外泌体中提取到了一定数量的线粒体DNA，但在AF 疾病组与正常组之间的差异无统计学意义。尽管有报道显示，外周血中的线粒体DNA 与氧化应激及心血管疾病有关，但目前在AF 中并没有发现这种相关性。