以类白血病反应为首发表现的慢性中性粒细胞白血病二例并文献复习

彭真萍，项喜喜，张苏江，李佳明

（1.上海交通大学医学院附属瑞金医院北院检验科，上海 201801；2.上海交通大学医学院附属瑞金医院血液科，上海 200025）

慢性中性粒细胞白血病 （chronic neutrophilic leukemia，CNL） 是一种极罕见的BCR-ABL 融合基因阴性的骨髓增殖性肿瘤 （myeloproliferative neoplasm，MPN），以外周血成熟中性粒细胞持续增多、骨髓中性粒细胞浸润和肝脾肿大为主要特点。患者的临床过程以进行性中性粒细胞增多为特征，其向急性髓细胞性白血病（acute myelogenous leukemia，AML）转化的中位时间为21个月。CNL 患者预后不良，生存期短，中位生存期仅为23.5个月，最常见的直接死亡原因为颅内出血和疾病进展，而大多数患者则死于治疗相关的并发症——难治性白细胞增多症。目前的治疗方案尚不统一，羟基脲、α 干扰素、诱导化疗等治疗虽可缓解患者的症状，但在生存期方面无获益。随着分子技术和靶向治疗的应用，CNL 的诊治有望明显改善。

近年来，随着CNL 的分子生物学、遗传学等方面研究的进展，采用基因突变检测来诊断CNL 已取得了较大的突破。2016 年，世界卫生组织将CSF3R 基因突变列为诊断标准之一，现已发现十几种CSF3R 基因突变，其中最常见的为CSF3R T618I和CSF3R T615A[1]。但鉴于CNL 的临床异质性，其诊断仍依赖传统的排除性标准。CNL 应特别注意与类白血病反应、慢性髓细胞性白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）、不典型慢性髓细胞性白血病（atypical chronic myelogenous leukemia，aCML）、骨髓纤维化及其他血液肿瘤相鉴别。本研究拟总结2例CNL 患者的临床资料、骨髓形态学及病理活检特点，并结合相关文献进行分析，以进一步提高临床对该疾病的识别能力。

资料与方法

一、资料

2010 年至2019 年期间，收集上海交通大学医学院附属瑞金医院门诊收治并经病理证实的2例以类白血病反应为首发表现的CNL 患者。

1.例1：患者为男性，38岁，因尿酸升高，且体检血常规发现白细胞计数增多（18×109/L）就诊，而其血红蛋白含量、血小板计数均正常。结合患者的外周血象及骨髓细胞形态学检查结果，当时考虑其为类白血病反应。予行骨髓染色体核型分析，结果提示为46，XY；骨髓白血病融合基因筛查示，JAK2 V617F（-）、BCR-ABL（-），未检测到常见的29 种白血病融合基因转录本；骨髓活检结果考虑类白血病反应可能。17个月后，患者复查骨髓形态学检查，结果显示感染或类白血病反应不排除。随访血常规检查，白细胞计数最高达36×109/L，遂予患者羟基脲、青黄散、中药及干扰素等治疗。后患者因血小板和血红蛋白降低，故自行停药。初次就诊4 年后，患者行CSF3R 突变检测，结果为阳性（T618I），被确诊为CNL。初次就诊6 年后，患者开始接受Janus 激酶（Janus kinase，JAK）抑制剂芦可替尼口服治疗，治疗约4个月，患者出现背部及左肋部疼痛；治疗约9个月后，患者行胸椎MRI 检查，结果显示胸9 椎弓根占位，占位向内侧生长压迫椎管。后患者在全身麻醉下，接受“胸椎弓根肿瘤切除钉棒系统内固定术”，病理活检报告提示为粒细胞肉瘤。PET-CT 检查提示脾脏、全身广泛骨骼浸润，胸段竖脊肌浸润[最大标准摄取值（maximum standard uptake value,SUVmax）=14.1]；右侧额叶、颞叶浸润可能（SUVmax=11.5）；右侧颈后三角、左侧锁骨上、双侧腋窝、两侧膈脚后淋巴结受侵可能（SUVmax=7.1）（见图1）。后患者为进一步治疗，至上海交通大学医学院附属瑞金医院北院就诊。我院医师结合患者的病史及骨髓形态学检查，诊断其为AML（CNL合并粒细胞肉瘤后转化），给予芦可替尼联合地西他滨联合IA、IAG 方案化疗3 次。

2.例2：患者为男性，58岁，因咳嗽、咳痰、乏力就诊，血常规检查发现白细胞计数明显增高（40×109/L），2个月后行骨髓穿刺病理学检查，结果提示类白血病反应可能性大。随访期间，患者的白细胞计数维持在（10～20）×109/L。初次就诊后2 年，患者双下肢反复出现片状瘀斑，呈明显贫血貌，但无骨痛。体格检查显示，患者的肝左叶在剑突下6 cm，边缘薄，质较硬，脾下缘在脐平线上约3 cm，质地充实。腹部B超显示其肝脾显著增大，脾脏大小为165 mm×70 mm。血清单克隆性IgA-λ 增高，血清β2微球蛋白10.40 mg/L，肌酐116 μmol/L。骨髓活检提示，浆细胞占30%。骨髓流式细胞仪检查免疫分型显示，异常细胞占白细胞总数的14%，表达浆细胞抗原，CD117+CD38+CD138+CD56+λ+。该病例经上海市血液学疑难疾病委员会专家会诊后诊断为CNL合并多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM），支持依据为以下2 点。①患者行JAK2 及BCR-ABL 基因检测，结果为阴性，可排除CML；②患者复查的外周血、骨髓象形态学改变及病理活检结果不同于类白血病反应，且白细胞持续增多2 年、脾大进行性加重，倾向于CNL。随后给予患者VCD 方案（万珂+环磷酰胺+地塞米松）化疗6个疗程。

图1 PET-CT 图像提示全身广泛骨骼浸润

二、方法

1.外周血涂片和骨髓涂片形态学检查：将新鲜外周血及骨髓穿刺液涂片进行瑞氏-吉姆萨染色后，在油镜（×1 000）视野下对外周血片及骨髓涂片进行有核细胞分类计数，骨髓涂片分类计数500个有核细胞，外周血片分类计数200个有核细胞。

2.外周血涂片和骨髓涂片细胞化学染色：对新鲜外周血片进行中性粒细胞碱性磷酸酶（neutrophil alkaline phosphatase，NAP）积分染色，试剂购自珠海贝索生物技术有限公司。在油镜视野下计数100个成熟中性粒细胞，分别将其按照 （-）、（+）、（++）、（+++）、（++++）的分级情况，计数为0、1、2、3、4 分，统计100个中性粒细胞中阳性细胞的积分之和为积分值。对新鲜骨髓片行过氧化物酶（peroxidase，POX）（魏希本法）染色，在油镜视野下计数100个原始细胞，并计数阳性百分比。细胞内出现棕黄或蓝黑色颗粒沉淀物质为阳性，染色反应程度划分如下。颗粒细小、散在稀疏分布的小颗粒为（+/-）；颗粒较粗、局灶分布为（+）；颗粒粗大、较密集，占细胞质面积的（1/2）～（2/3）为（++）；颗粒粗大、团块分布，布满细胞质为（+++）；细胞质内充满团块染色并覆盖细胞核为（++++）。

3.病理学检查： 活检组织标本均经4%甲醛溶液固定，常规脱水后用石蜡包埋、切片，行苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色和免疫组织化学（免疫组化）染色，在光学显微镜下观察。同时连续切片行免疫组化检测，所用一抗为MPO、CD43、CD117、TDT、CD19、CD20、CD22、CD79α、Ki-67、Bcl-2、Bcl-6、CD5、CD10、CD3、CylinD1、CD56、CD23、CD25、CD21、CD15、Mum-1、ALK1、PAX-5、CD30、S-100、EMA、CKpan、CD138 及CD38 等。所用试剂购自基因科技（上海）有限公司。

4.骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）/MPN 相关基因检测：取患者初诊和复诊时骨髓液，样品送至上海睿昂生物技术有限公司完成DNA 测序分析。检测基因包括CSF3R、ASXL1、SETBP1、JAK2、CALR、SF3B1、2SRSF2、U2AF1、DNMT3A、IDH1、IDH2、TET2、TP53、SF3B、RUNX1、NRAS、EZH2、CBL、ETV6 等。

结果

一、外周血及骨髓形态学特征

1.外周血形态特征：例1 患者外周血片成熟中性粒细胞占91%，且可见颗粒增多、增粗现象（见图2）。初诊后约7 年，患者复查外周血单核细胞持续高于1×109/L，且中性粒细胞可见颗粒增多、增粗现象（见图3），NAP 积分明显增高，为248 分。例2 患者的外周血白细胞总数增高，外周血成熟中性粒细胞占90%（其中中性杆状核粒细胞占4%、中性分叶核粒细胞占86%），NAP 积分明显增高，为300 分。

2.骨髓象形态学特点：例1 患者的初诊骨髓象考虑为类白血病反应，可见骨髓有核细胞增生明显活跃，粒系细胞增生显著（占84.4%），中幼粒细胞增生为主，中性粒细胞可见颗粒增多、增粗现象（见图4）。患者发生CNL 转化为AML 后，骨髓形态学检查提示，骨髓有核细胞增生活跃，原始细胞占15%，幼单细胞占8%，粒系占50%，以成熟中性粒细胞为主，大部分粒细胞可见颗粒增多、增粗现象。该类原始细胞POX 染色结果为 （-）63%，（+/-）19%，（+）13%，（++）5%（见图5、6）。

例2 患者的骨髓象特点为，骨髓增生极度活跃，粒细胞增生显著活跃，中幼粒、晚幼粒细胞占26%，成熟阶段粒细胞占26%，中性粒细胞可见颗粒增粗现象；浆细胞占30%（见图7）。

图2 CNL 外周血片特征（例1）（瑞氏染色，×1 000）

图5 CNL 向AML 转化的骨髓涂片特征（例1）（瑞氏染色，×1 000）

二、病理学检查

图6 CNL 转化为AML 骨髓涂片特征（例1）（POX染色，×1 000）

图7 CNL 合并MM 时骨髓涂片特征（例2）（瑞氏染色，×1000）

1.例1：例1 患者初诊后约6 年的骨髓活检病理显示，符合CNL（见图8），提示造血与脂肪组织之比为9∶1，粒细胞与红细胞比为20∶1，粒系明显增生（+++），幼稚前体细胞异常定位+或-，红系增生减低，巨幼变细胞-，巨核细胞正常，小圆巨核细胞-，裸核型巨核细胞-，网状细胞-，马松（Masson）三色染色显示胶原纤维-；淋巴细胞百分比为2%。患者的CNL 胸9 椎弓（占位）切除标本经病理学结合免疫组化检查，结果提示为粒细胞肉瘤，结合其他临床特征，符合CNL 侵犯胸9 椎弓（见图9）。免疫组化标志物检测结果为，肿瘤细胞MPO （3+），CD43（2+），CD3（-），CD5（-），CD20（-），PAX-5（-），CD79α（-），CD30（-），ALK1（-），CD15（-），Mum-1（-），Bcl-6（-），CD10（-），c-myc（-），TDT（-），S-100（-），EMA（-），CKpan（-），CD117（-），PLAP（-），Ki-67 约80%（+）。患者的EB 病毒编码RNA（Epstein-Barr virus encoded RNA，EBER）原位杂交结果提示阴性。

2.例2：例2 患者的骨髓活检病理片显示，造血组织极度增生，浆细胞百分比增多（20%～30%），并成簇分布，可见大量中性粒细胞增生，原始细胞很少（见图10）。

三、基因检测及染色体分析

图8 CNL 骨髓活检病理图片（例1）（HE 染色）

图9 CNL 转化为AML 患者的椎弓活检病理图片（例1）（HE 染色）

图10 CNL 合并MM 骨髓活检病理图片（例2）（HE 染色）

例1 患者诊断为CNL 时，其骨髓MDS/MPN 相关基因突变检测提示CSF3R T618I [变异等位基因频 率 （variant allele frequency,VAF） 83.76%] 和W818X 突变 （VAF 82.87%）、ASXL1 E657fs 突 变（VAF 22.71%）、RUNX1 R204Q 突变（VAF 3.97%）。当其转化为AML 时，骨髓基因突变检查结果则提示，CSF3R T618I （VAF 90.81%） 和W818X 突变（VAF 83.77% ）、ASXL1 E657fs 突变 （VAF 8%）、RUNX1 R204Q 突变（VAF 41.38%）。患者的椎弓活检组织经检测发现CSF3R T618I （VAF 92.91%）和W818X 突变 （VAF 92.91%）、ASXL1 E657fs 突变（VAF 11.05%）、RUNX1 R204Q 突变（VAF 43.49%）（见表1）。

例1 患者由CNL 转化为AML 时，骨髓与椎弓活检组织基因突变结果基本一致。在CNL 向AML转化过程中，RUNX1 R204Q 突变VAF 明显增高，ASXL1 E657fs 突变VAF 降低。例1 患者诊断为CNL 时，其对芦可替尼治疗有反应，血象及脾肿大明显改善；而当其转化为AML 时，则对芦可替尼及地西他滨治疗无效，血象及脾肿大均恶化。

例1 患者骨髓染色体核型分析提示，患者为48，XY，+8，+10，+21[CP2]/46,XY。

例2 患者的骨髓染色体核型正常，荧光原位杂交检测提示存在1q21 扩增。

四、随访结果

例1 患者CNL 转化为AML 后，予地西他滨联合急性白血病标准方案诱导化疗，骨髓提示未缓解，最终患者死于脑出血。例2 患者诊断为CNL 合并MM,予万珂为主方案化疗后，MM 完全缓解，CNL完全缓解；后用沙利度胺维持2 年，随访至2019 年9 月，患者存活。

讨论

一、临床表现

CNL 是一种罕见的CML，该病患者的外周血及骨髓细胞形态学具有不同于其他MPN 的增生特征，其发病较隐匿，具有高度的临床异质性。多数CNL 患者在就诊时无明显症状，或因脾肿大、腹胀就诊，或仅体检出现外周血白细胞计数增高。患者的主要症状包括乏力、食欲减退、盗汗、骨痛、紫癜和体质量减轻等。CNL 诊断时，患者的中位年龄为66.5岁（15～86岁），男性占56%～57%[1]，其临床过程表现为慢性期、加速期以及急变期。由于目前对于CNL 缺乏大宗的流行病学研究，关于该病的病因及肿瘤起源尚不清楚。

有学者认为，MM 和CNL 共同起源于异常的造血干细胞，其具有分化为髓系和淋巴系的潜能。CNL 中粒细胞的异常克隆性增殖可能起源于比髓系祖细胞分化更早期的阶段，而有些骨髓瘤细胞表面同时表达单核细胞和浆细胞抗原，因此认为二者可能由一个细胞系分化而来[2]。20%以上的CNL 患者伴有其他肿瘤性疾病，多为MM，粒细胞肉瘤罕见。本研究中例2 患者被诊断为CNL 合并MM。此类病例在国内外已有多例个案报道[3]。本研究报道了1例CNL 合并粒细胞肉瘤患者，国内尚未见类似报道，而CNL 与粒细胞肉瘤的细胞起源还需进一步研究。

表1 例1 基因突变分析

二、骨髓、外周血细胞形态学和骨髓组织病理学特征

CNL 典型的形态学表现是外周白细胞持续增多（≥25×109/L），持续时间一般大于3个月，外周血片中性分叶核和杆状核粒细胞占白细胞的百分比≥80%，幼粒细胞＜10%,原始细胞罕见，单核细胞计数＜1×109/L，除粒细胞出现明显颗粒增多、增粗外，一般无病态改变。NAP 积分明显升高。骨髓增生明显或极度活跃，中性粒细胞比例明显增高，细胞成熟正常；原始粒细胞＜5%。骨髓活检病理显示，粒细胞/红细胞比值明显增高，大量中性粒细胞增生，原始细胞很少。

三、分子学特征

近年分子生物学的研究进展为诊断CNL 提供了重要依据，在2016 年WHO 修订版髓系肿瘤诊断标准中，CSF3R 基因突变被纳为CNL 的诊断标准[4]，这也是CNL 与其他MPN 相鉴别的关键点。2013 年Maxson 等[5]发现了CSF3R 基因突变在CNL中的高发生率及特异性，并被其他多个研究证实[6-7]。除了常见的CSF3R 突变，SETBP1、ASXL1、SRSF2、RUNX1、TET2 等基因突变常与CSF3R 突变共同出现，并有学者发现CNL 病例检测到JAK2 V617F 基因突变[8]，其突变频率与其他MPN 相似。在回顾已报道的CSF3R 突变的CNL 病例中，SETBP1 和ASXL1 突变率相对较高[9-10]。CNL 中的SETBP1、ASXL1 突变都与预后不良相关[11-12]，而aCML 患者与SETBP1 及ETNK1 基因突变相关[13]。本研究中病例1 出现了CSF3R、ASXL1 及RUNX1突变，并在CNL 转化为AML 时，其RUNX1 基因突变频率明显升高。

四、诊断及鉴别诊断

CNL 需与以下疾病鉴别。

1.类白血病反应：类白血病反应是机体受某些疾病或外界因素刺激后所产生的类似白血病的血象反应，其中中性粒细胞型最常见，患者的白细胞总数可达50×109/L，可出现幼粒细胞甚至原始细胞；骨髓增生明显或极度活跃，以中性粒细胞增生为主；外周血片和骨髓片的中性粒细胞均出现核左移，颗粒增多和（或）增粗、杜勒小体、退行性变及空泡等毒性改变，但患者无肝脾肿大。原发疾病经治疗后，患者的外周血白细胞恢复正常。

2.CML：CML 患者的白细胞总数明显增高，脾脏肿大甚至巨脾；其外周血片和骨髓片中嗜酸、嗜碱性粒细胞比例增高，NAP 积分明显降低甚至为0 分；骨髓片中粒、红二系病态轻微，巨核细胞体积较正常偏小，称“侏儒巨”，部分可见假戈谢及海蓝组织细胞。CML 患者费城（Ph）染色体阳性，BCRABL 融合基因检查阳性。

3.aCML：CNL 和aCML 患者均无Ph 染色体及BCR-ABL 融合基因。两者临床血象特征有时很难鉴别，但aCML 外周血可见白细胞持续增高及较多幼粒细胞（幼粒细胞≥10%），其具有独特的粒系病态改变，可见假性Pelger-Hüet 畸形，染色质浓集、副染色质清晰的情况下仍然分叶不能，同时伴有少颗粒现象，有时病态还可累及红系、巨核系。

4.中性粒细胞-慢性粒细胞白血病[14]：近年来，已经出现BCR-ABL1 融合基因阳性的CNL 病例，即Ph 染色体阳性的CNL。然而，这种融合基因不同于CML 或Ph 染色体阳性急性淋巴细胞白血病中所见的断裂点丛区。典型的CML 的断裂点在MBCR，产生p210 蛋白；而Ph 染色体阳性急性淋巴细胞白血病中见到的断裂点在m-BCR，产生p190蛋白。Haskovec 等[15]报告的CNL 病例则为μ-BCR，产生p230 蛋白。有学者建议，这些病例应称为中性粒细胞-慢性粒细胞白血病。

CNL 易与CML、aCML 及中性粒细胞-慢性粒细胞白血病相混淆，应结合患者的骨髓细胞形态学检查结果、基因及染色体等分子生物学特征进行鉴别诊断，有助于降低误诊率。本研究的2例患者初诊时骨髓均提示类白血病反应，但经历抗感染等治疗后，白细胞计数仍高且超声显示脾脏呈增大趋势，例2 肝脾均显著增大，结合骨髓形态学检查及CSF3R 基因检测，诊断为CNL。

五、治疗及预后

近年来,关于分子靶向药物在CNL 中的临床应用，证实CSF3R T618I 突变阳性的患者对JAK2抑制剂芦可替尼敏感。本研究中例1 患者口服芦可替尼，其临床症状及白细胞计数均明显改善。有报道称，SETBP1 突变与芦可替尼耐药相关[9]；同时，携带CSF3R S783fs 截断突变患者对达沙替尼敏感。CNL 患者预后不佳，其中位生存期约为2 年，尤其携带多种基因突变的患者生存率更低，相关的靶向药治疗仍需大规模临床实验验证。

总之，CNL 具有临床异质性，可与其他血液肿瘤同时存在，并存在向AML 转化的高风险。以CSF3R 基因突变为特征的分子诊断标准，有助于CNL 的鉴别诊断。然而，对于寻找有效的分子靶向治疗仍有待进一步探索。