低温灌注液灌注保存肢体的研究进展

石桩 ， Sergeen Orgoi， Bayarmaa Enkhbat， Sayamaa Lkhagvadorj， 于满柱 ， 杜兰

（1.内蒙古民族大学附属医院 手足显微外科，内蒙古自治区 通辽 028000；2.蒙古国国立医科大学，蒙古国 乌兰巴托）

20世纪30年代，Allen[1]首次通过研究温度对离断肢体缺血耐受产生的影响，发现低温条件能够有效地降低组织代谢活性，同时指出，最适温度应该是未引起组织损伤的最低温度。并推荐干燥低温保存方法即用纱布包裹断肢放入塑料袋密封后，放入冰水中干燥冷藏，该方法一直沿用至今。虽然低温能够有效地减少细胞组织代谢的速率，控制组织变性过程，但需要强调的是：低温冷藏保存只是降低细胞代谢反应的速度，并不能停止组织细胞代谢。从而很多学者研究在低温冷藏保存的基础上应用多种灌注液对离断肢体进行灌注后都相应地延长了肢体再植的时限，其中灌注液包括器官灌注液、自由基清除剂灌注液、能量合剂灌注液、中药制剂灌注液、血液代用品以及全血等。通过灌注液对肢体进行灌注能解除血管痉挛、扩张血管管腔、恢复毛细血管的吸收功能，为重建血液循环提供良好的血管基础，并通过灌注为组织提供代谢所需的基本能量物质，从而使组织可以保持低代谢状态，有利于维持细胞膜稳定性，且通过灌注有效地冲洗出组织中存积的乳酸等代谢产物及血管中残留的血液和血凝块，减少再植后机体对代谢产物的吸收，降低氧自由基等有害成分的生成，减轻细胞内酸中毒及缺血再灌注损伤。本文通过广泛查阅国内外有关低温灌注法保存肢体文献，对低温灌注保存方法的研究进展进行分析总结。

1 器官灌注液灌注保存

在器官移植外科学中，应用器官灌注液如UW液、HTK液、Euor-Collins液及Celsior液等灌注低温保存移植器官较广泛，同样在国内外对离断肢体进行器官灌注液灌注低温保存也有较多的研究。

早在1989年Beppu等[2]将实验犬的前肢离断后用EC液灌注在4℃下保存72 h（总缺氧78.5 h）后再植，经组织学检查评估发现所有再植肢体的骨骼肌均成活。Gordon等[3]对实验犬离断肢体模型分别用UW液低温脉冲式灌注和单纯低温冷藏保存12～15 h后进行组织中ATP含量测定及组织学检查，发现低温灌注组因缺血引起的组织损伤速度较单纯低温组慢三倍。由此他认为用UW液低温灌注法保存断肢效果优于单纯低温保存，可作为离断肢体保存的方法。Tsuchida等[4]用大鼠后肢建立断肢模型后经UW溶液灌注并在25℃下保存5h与不灌注单纯保存组相比较，同时检测肌肉组织中的ATP和血清肌酸磷酸激酶。结果表明100 cm H2O压力下灌注UW液可明显保持肌肉的活性。有些学者将器官灌注液灌注保存法应用于临床实践中，1995年Kour等[5]在临床手术中对两例离断肢体采用1 000 mL UW液以120 cm H2O进行灌注并在4℃下保存，缺血时间分别是7 h和ll h。再植术后无明显肿胀，无不良反应，远期随访肢体运动功能恢复良好。

2 自由基清除剂灌注液灌注保存

组织器官在缺血和再灌注过程中，产生大量O-2、H2O2和形成OH-等氧自由基，这一类活性氧簇损伤脂质(包括生物膜)、蛋白质(包括酶、结构功能蛋白)和核酸等。在很多缺血-再灌注损伤的实验模型中，用自由基清除剂预先灌注处理后很好地减轻了缺血-再灌注损伤作用，所以自由基清除剂灌注液灌注保存离断肢体有良好的应用前景。

自由基清除剂灌注液主要包括低分子清除剂及酶性清除剂灌注液两种。其中低分子清除剂包括：脂溶性Vit E和Vit A和半胱氨酸、Vit C、还原型谷胱甘肽(GSH)和NADPH等；酶性清除剂包括：细胞内的过氧化氢酶(CAT）和过氧化物酶(如GSHPx)以及超氧化物歧化酶(SOD)等。Yan等[6]针对大鼠后肢缺血模型给予四氢生物蝶呤、L-精氨酸和维生素C协同补充，从而增加一氧化氮生物活性，减少氧化应激，促进侧支循环形成和减少肌肉坏死，改善大鼠后肢缺血后的血流恢复。Rocca等[7]对大鼠下肢急性缺血模型分别采用超氧化物歧化酶灌注液(SOD)和生理盐水灌注，10 d后肢体的存活百分比和再灌注pmO2数据结果表明SOD对缺血-再灌注引起的骨骼肌损伤有确切保护作用。李继峰等[8]在超氧化物歧化酶灌注对大鼠离体血管平滑肌超微结构影响的研究中应用SOD和生理盐水灌注大鼠离断肢体，并4℃保存。观察血管平滑肌超微结构的变化，经SOD灌注后股动脉血管平滑肌超微结构变化明显延缓，对血管平滑肌有保护作用。

3 能量合剂灌注液灌注保存

顾玉东等[9]在离断肢体血管与肌肉保护的实验研究中通过对大鼠离断肢体模型给予能量合剂(能量合剂配制：100 mL林格中含ATP10 mg、辅酶Q1050 mg、维生素B650 mg、地塞米松5 mg)灌注，电镜观察超微结构变化，用赵卫国法及Goldberg法测定组织内Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶。结果显示低温能量合剂灌注对血管和骨骼肌超微结构及酶活性均有保护作用。刘晓钟等[10]将低温能量合剂持续灌注法应用于超时断肢再植中，在对11例超过再植时限的断肢进行低温灌注后再植，仅有一例高位断肢再植术后因感染截肢，其余全部成活，肢体功能均不同程度恢复，从而证明在超时限断肢再植术中使用低温能量合剂灌注法，具有较好的辅助治疗作用。

4 中药制剂灌注液灌注保存

离断肢体缺血缺氧及再灌注造成的损伤是由氧自由基及炎症反应等多因素综合作用的结果，很多研究表明含多种有效成分的中药如丹参、银杏叶提取液、灯盏花素及血必净注射液等，改善毛细血管通透性、减轻细胞水肿，降低细胞膜通透性、抑制氧自由基的产生、减少脂质过氧化物的形成，从而减轻缺血及再灌注的损伤。

于蓉、范里等[11-12]通过制备家兔下肢缺血损伤模型，经静脉注射丹参液后观测缺血-再灌注后微循环变化，证实丹参可以抑制氧自由基的产生，对缺血-再灌注起到保护作用。徐韶怡等[13]对40例上肢离断再植病人进行分组并术后给予川芎嗪及乌司他丁治疗。测定患者血清天冬氨酸氨基转移酶（AST)、肌酸激酶（CK)、乳酸脱氢酶（LDH)、丙二醛(MDA)和超氧化歧化酶(SOD)的含量变化。总结出川芎嗪和乌司他丁对断肢再植缺血再灌注损伤具有一定的保护作用，联合使用效果更佳。崔昌胜等[14]通过建立新西兰白兔缺血肢体模型4 h后给予脉络宁注射液，同时检测血浆TNF-α和肌组织NF-κB浓度，用透射电镜对肌组织超微结构进行观察后认为脉络宁注射液可降低缺血/再灌注后血浆TNF和肌组织NFB浓度的升高程度，减轻肌细胞水肿，有利于维持细胞内超微结构的完整性，对骨骼肌IRI起到保护作用。

5 血液代用品灌注保存

还有很多学者利用血液代用品灌注离断肢体，从而减轻组织缺血缺氧损伤及再灌注损伤，达到有效保存离断肢体的目的。Smith等[15]对5例患者断肢(指)进行氟碳液Fluosol DA-20%灌注保存，根据不同情况，灌注时间从16～46 h不等，随后进行再植。再植前后监测pO2及乳酸、葡萄糖和ATP的水平，并进行光镜及电镜组织学检测等。术后3例断肢(指)再植成活，Fluosol DA-20%灌注不仅能降低组织缺血-再灌注损伤，还能有效地延长断肢(指)保存时限。Yabe等[16]利用氧饱和过氟化合物灌注兔离断后肢模型后进行保存，并在电镜下对骨骼肌细胞及血管内皮细胞进行评估，并检测ATP含量。测量结果显示，氧饱和过氟化合物灌注保存6 h后使肌细胞与血管内皮细胞几乎处于正常状态，ATP含量明显高于低温保存组水平，表明氧饱和过氟化合物灌注方法保存离断肢体令人满意。Araki等[17]研制出一种人工携氧血红蛋白囊泡（HbVs），将大鼠离断肢体分别经ETK溶液和HbVs溶液灌注6 h并在常温下保存后进行再植，结果显示离断肢体经HbVs灌注后比单纯ETK液灌注有更好的氧合作用，腓肠肌保存完好，有利于再植存活率。

6 全血灌注保存

在器官移植外科中，很多学者研究利用体外循环全血灌注技术对离体的肝脏、肾脏和肺等器官进行灌注保存。同样对离断的肢体也进行了体外循环全血灌注保存的实验研究，Domingo-Pech等[18]在体外灌注保存离断的犬后肢的研究中，将犬离断后肢模型应用体外循环灌注的方法保存24 h后再植，并与离断即刻再植的犬肢体进行比较，结果显示经体外循环灌注保存后降低组织水肿，肌纤维化改善，愈合良好。Constantinescu等[19]通过体外循环自体血灌注猪离断前肢模型保存12 h，与单纯冷藏对照组进行比较研究，结果表明经体外循环自体血灌注保存后组织内pH值稳定，缺血缺氧损伤轻，对离断肢体保护有效。

7 展望

离断肢体在重建血液循环之前应进行简单易行且费用较少的正确合理保存，为再植手术赢得时间，减轻缺血再灌注损伤，而且提高再植成活率及术后功能恢复。目前肢体保存法除了广泛应用的低温干燥冷藏法外还包括深低温冷冻保存、低温灌注液灌注保存、高压氧保存、异位寄养保存等方法，各种方法各有利弊，其中低温灌注液灌注保存法操作较其他保存法简单易行，且费用相对较低，保存效果方面很多研究表明通过多种灌注液对离断肢体灌注低温保存后均获得了良好的保存效果。本文仅介绍了应用各种灌洗液保存离断肢体的方法，但具体哪种成分的灌注液最适合肢体这种复合组织的保存，单次灌注还是持续灌注，灌注过程中设定多少灌注压力及灌注速度（理论上应该低于正常血流速度及压力，防止高压灌注对组织产生的机械性损伤，低压灌注对组织灌注不彻底），灌注后的最佳保存时间为多久等诸多问题有待进一步去探讨研究解决，并且根据断肢损伤情况、所处环境以及再植要求，选择合适的灌注液保存。