新视角探析微生物对葡萄酒品质的影响

王伟雄，古丽米热·祖努纳，杜展成，刘秀海，卢丕超，武运*

（1. 新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2. 新疆芳香庄园酒业股份有限公司，新疆和硕 841200；3. 吐鲁番楼兰酒庄股份有限公司，新疆鄯善 838200；4. 中信国安葡萄酒业股份有限公司，新疆乌鲁木齐 830052）

关键字：酿酒酵母；非酿酒酵母；乳酸菌；混菌发酵；陈酿；发展趋势

葡萄酒发酵并不是单一微生物的作用产物，而是多种微生物在葡萄酒酿造中互作的结果。葡萄酒作为产量最大的果酒，其酿造工艺的创新、本土酵母纯化筛选、葡萄酒成分分析等都是热门研究方向[1-2]。此外，有研究表明，葡萄酒发酵过程中微生物的相互作用可能会影响葡萄酒的感官特性[3]。酿酒酵母具有很强的嗜杀性，具有抵御外界微生物攻击的能力；酿酒酵母还具有较高的耐受性，能够在高渗透压、高酸、高酒度等环境中正常生长繁殖，因此能保障葡萄酒发酵的顺利完成[4]。自然发酵工艺被越来越多的酿酒师应用，并发现葡萄品种的典型性需通过筛选的非酿酒酵母体现出来，通过本土酵母酿造的葡萄酒，更能突出葡萄酒的典型性[5]。乳酸菌在葡萄酒发酵过程中的应用可以增加葡萄酒生物学稳定性[6]，改变葡萄酒中的内酯类、萜烯类、脂肪酸、酯类和高级醇等物质成分的含量及平衡关系，对葡萄酒的风味起到修饰作用[7-8]。葡萄酒酿造过程中选择合适的酵母菌及乳酸菌进行酿造，将会成为葡萄酒酿造领域的热点问题。本文对酿酒酵母、非酿酒酵母，以及乳酸菌对葡萄酒品质的影响进行综述，并对混菌发酵进行展望，以期为葡萄酒酿造生产提供多种发酵策略。

1 酿酒酵母

1.1 酿酒酵母的种类

酵母菌的种类繁多，不同的科、属具有不同的形态特征和生理生化特点，直接参与葡萄酒发酵的酵母菌属有：罗氏酵母（Sac c haromyce s rosei）、裂殖酵母（Schizosaccharomyces）、类酵母（Saccharomycodes）、尚德酒星形球拟酵母（Torulopsis stellata）、德克酵母（Dekkera）、汉生酵母（Hansenula）、卵型酵母（Saccharomyce oviformis）、克勒克酵母（Kloeckera）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、酒香酵母（Brettanomyces）、葡萄酒酵母（Saccharomyce sellipsoideus）、柠檬形克勒克酵母（Kloeckeraanicnlata）、产酸酵母（Saccharomyces acidifaciens）、子囊菌纲酵母（Saccharomyces）等25个属150多种[9-10]。

1.2 酿酒酵母的基本特性

1.2.1 酿酒酵母的嗜杀性

嗜杀性是指能有效抵御外界微生物攻击的能力，酿酒酵母嗜杀性较强，对外界微生物抗干扰能力及抵御能力较强，对葡萄酒发酵起到保护作用[11]。嗜杀酵母是指在某些酵母繁殖和生长过程中，能抑制或杀死某些毒素蛋白[12]。毒素蛋白被称为嗜杀毒素，嗜杀酵母对其自身分泌的嗜杀毒素具有免疫力[13]。

1.2.2 酿酒酵母能产生硫化氢

研究发现，酿酒酵母代谢产生的硫化氢主要发生在发酵过程中。含硫化合物是在葡萄酒生产中的一类污染物质，挥发性较强且散发出不愉快的气味，这些气味通常被描述为洋葱味、臭鸡蛋味或大蒜味，对葡萄酒的香气和风味产生了严重影响[14-15]。它与醇类物质结合会形成具有毒性的硫醇，并且很难去除[16]。

1.2.3 酿酒酵母的絮凝性

酵母絮凝是无性聚集，它是由于细胞表面凝集素与细胞壁中甘露聚糖相互作用而产生[17]。而絮凝性是酵母在葡萄酒发酵过程中、细胞生长结束时或糖分耗尽后形成的絮状物，并具有粘附成团状化合物最终沉降的特性。在葡萄酒生产后期较强的絮凝性有利于葡萄酒澄清过滤[18]。

1.2.4 酿酒酵母的耐受性

酿酒酵母在高渗透压环境下可以正常代谢，其具有快速转化糖醇和快速繁殖能力，因此能够在恶劣的发酵环境中生存[19]。随着酿酒工业科技的发展，浓醪发酵新技术逐渐代替传统发酵技术，该新工艺下醪液中的酒精浓度和糖度较高，耐糖、耐酒精酵母的使用，对产品质量提升具有重要意义[20]。

酿酒酵母在低pH环境下具有耐受性，在酸度较高的葡萄醪中可以完成正常发酵。相关研究表明，耐酸酵母的使用具有较高的市场应用前景，除对低pH有耐受能力外，还可以在极低pH环境下正常繁殖代谢[21]。

低温发酵对于提高葡萄酒品质，增加葡萄酒香气种类具有重要意义，是高品质葡萄酒酿造以及冰酒酿造探寻的热点问题。酿酒酵母对低温的耐受力决定其在低温环境中能否正常生长繁殖代谢，最终影响葡萄酒品质。冯莉[22]对本土野生酵母进行筛选，对酿酒酵母低温耐受性主效QTL定位得到主效基因，为酿酒酵母低温耐受机理提供重要的理论依据。

在葡萄酒酒精发酵过程中，随着酒精含量升高，酵母细胞膜的通透性也随之发生改变，从而抑制酵母菌的正常生长繁殖，降低发酵速率，甚至会终止发酵[23]。酿酒酵母有较高的乙醇耐受性，可以保障酒精发酵的顺利进行。

2 非酿酒酵母

2.1 非酿酒酵母的分类

非酿酒酵母包括很多不同的菌种。目前，从葡萄汁中分离出来的非酿酒酵母已超过40种，大致分为三类：（1）需氧型酵母，如毕赤酵母属（Pichiaspp.）、假丝酵母属（Candidaspp.）、红酵母属（Rhodotorulaspp.）等；（2）发酵能力较弱的酵母，如罕见有孢汉生酵母（Hanseniaspora occidentalis）；（3）在发酵过程中能有一定程度参与的酵母，如拜氏接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）、戴尔有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）[24]。

2.2 非酿酒酵母的来源及生存环境

非酿酒酵母广泛存在，在葡萄园和果皮表面数量较多，在酿造环境中也有少量存在，它们会随着浆果的破碎进入发酵设施然后参与发酵过程[26]。研究表明，在发酵过程中非酿酒酵母菌株种属的差异也会导致各菌株生存状况有差异。虽然葡萄汁营养丰富，能为非酿酒酵母提供一个良好的生长环境，但是发酵过程中的高渗透压、低pH值和较高的SO2含量等条件，往往会成为影响非酿酒酵母菌细胞总数的主要因素[27]。在低温条件下非酿酒酵母能保持较高的发酵能力，而高于25 ℃时则会抑制非酿酒酵母的生长[22]。

2.3 非酿酒酵母的作用

尽管酿酒酵母的使用为葡萄酒酿造提供诸多便利，但是随着商业酿酒酵母大范围的使用，单一使用商业酿酒酵母可降低葡萄酒发酵环境中生化反应的复杂程度，会影响葡萄酒发酵环境中微生物多样性，无法充分体现本土酵母对葡萄酒品质的影响[28]。非酿酒酵母作为葡萄酒发酵前期的主要动力来源，其细胞总数在发酵前期甚至能够超过酿酒酵母[29]。同时，非酿酒酵母在发酵过程中产生的一些代谢产物会对葡萄酒最终的风味产生极大的影响[30]。一些非酿酒酵母可以生成更多的酯类、甘油、高级醇等具有提高香气复杂性、降低酒精度以及丰富口感作用的代谢产物[31]。

综上所述，非酿酒酵母在葡萄生长过程和葡萄酒酿造环境中广泛存在，非酿酒酵母的使用逐渐成为葡萄酒酿造的热点问题，但是非酿酒酵母在葡萄醪环境中生长缓慢，酒精转化力较弱，利用非酿酒酵母纯种发酵可能会导致葡萄酒发酵延滞[32]。由于商用酿酒酵母菌的种类比较单一，形成的代谢产物相似，尤其是风味化合物同质化现象严重，降低果酒的口感以及风味复杂度，影响果酒的潜在多样性，不能满足消费者的多样化需求[33]。

3 乳酸菌

苹果酸-乳酸发酵（MLF）发生于葡萄酒酒精发酵（AF）的后期，其原理是双羧基L-苹果酸被苹果酸-乳酸菌（MLB）产生的苹果酸-乳酸酶（MLE）降解成CO2和单羧基的L-乳酸的过程[34]。乳酸菌是MLF过程中最相关的微生物类群之一。它们负责苹果酸在MLF中的脱羧作用，MLF在大多数红葡萄酒和少量白葡萄酒发酵中均有应用[35]。

在MLF过程中，乳酸菌可分解苹果酸，消耗细菌繁殖营养物质，产生细菌素，从而抑制不良细菌生长，提高葡萄酒的生物学稳定性，降低了其他微生物对葡萄酒的危害，避免葡萄酒在贮存陈酿期间发生再发酵，有利于葡萄酒长期贮存[36]。而且，MLF在乳酸菌的参与下，除带来主要的感官感受（耗尽葡萄酒中的苹果酸）外，MLF还可以通过释放显著浓度的二乙酰（2,3-丁二酮）和其他从柠檬酸中获得的羰基化合物来改变葡萄酒的芳香特性，这些化合物赋予了葡萄酒黄油香气。同时在MLF中发生的其他生化反应也能提高葡萄酒的香气质量。蛋氨酸代谢、酯酶活性和一些涉及糖苷酶的转化也在试验中得到证实[37-38]。

乳酸菌发酵可以提高葡萄酒中氨基甲酸乙酯和生物胺的含量，使葡萄酒的安全性风险增加，部分酿酒酵母也会在发酵过程中生成有害代谢物，如氨基甲酸乙酯[33]。氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，EC）的致癌性已经被证实，其多出现在发酵食品和饮料中，参与EC形成的主要化合物是酵母分解代谢精氨酸产生的尿素，但也有其他化合物，如瓜氨酸（由细菌代谢产生）。瓜氨酸由葡萄酒乳酸菌通过精氨酸脱亚胺酶途径降解精氨酸而产生，因此经MLF的葡萄酒中可以发现EC含量的升高[39]。乳酸菌产生生物胺被广泛报道，Moreno-Arribas[40]分离的植物乳杆菌、希氏乳杆菌和短乳杆菌菌株，能够在酿造条件下产生某些生物胺。由于存在这些产生生物胺的乳酸菌，因此经过MLF的葡萄酒中可以发现生物胺水平的提高[41]。

乳酸菌在葡萄酒MLF中发挥着重大的作用，MLF在大部分红葡萄酒和少部分白葡萄酒中均有应用[35]。乳酸菌的参与可以增加葡萄酒的生物学稳定性、修饰葡萄酒的风味[36]。但是，它的参与同样会给葡萄酒带来风险，例如，EC含量的升高和生物胺含量的提高[39]，如何保证MLF过程中葡萄酒质量的安全性，将是未来研究的热点方向。

4 发展趋势

4.1 酿酒酵母与非酿酒酵母混合发酵

“非酿酒酵母”一词过去曾被用来指在葡萄发酵成葡萄酒过程中具有次要相关性的一组物种，甚至被认为是腐败有机体。最近，有研究发现，非酿酒酵母能在发酵中产生独特的代谢物来提高葡萄酒的质量，因此人们开始对其产生强烈期望并进行筛选来用作发酵剂[42]。然而，非酿酒酵母菌通常表现出较低的发酵性能，并且在整个发酵过程中无法在数量上占主导地位，且其对乙醇的耐受性较弱，故不可能在酿酒过程中完成酒精发酵。商用酿酒酵母菌的种类比较单一，形成的代谢产物相似，尤其是风味化合物，导致风味同质化现象严重，降低果酒的口感以及风味复杂度，影响果酒的潜在多样性，不能满足消费者的多样化需求[33]。因此，酿酒酵母与非酿酒酵母可作为共发酵剂接种，以发挥它们的积极作用，降低发酵停滞或发酵变质的风险[43]。在葡萄酒生产中，将非酿酒酵母菌与酿酒酵母菌接种作为共发酵剂是一种很有前景的酿酒实践，这种方式在酒窖中的应用正在稳步增加[42]。

不同种类的非酿酒酵母与酿酒酵母混合发酵对葡萄酒品质的影响有明显差异。例如，戴尔有孢圆酵母与酿酒酵母混合发酵提高了葡萄酒中某些酯类的含量，葡萄酒果香更加强烈[44]；美极梅奇酵母与酿酒酵母混合发酵使葡萄酒中乙酸异戊酯、苯乙醇等含量增加，赋予葡萄酒强烈的花香和水果香气。研究表明，非酿酒酵母与酿酒酵母不同的接种方式会对葡萄酒品质产生影响，通过改变接种比例，葡萄酒中的香气成分会发生显著变化[45]。混合发酵方式虽可以提高果酒的品质，但特定非酿酒酵母在混合发酵中可能会引起其与酿酒酵母的拮抗作用，积累一些不理想代谢物[46]。

4.2 酵母菌与乳酸菌混合发酵

酵母菌与乳酸菌共发酵生产酒类饮料时，由于菌种间的协同作用，会产生有机酸、醇类、酯类等化合物，产物要比纯种发酵更加丰富，赋予葡萄酒更加复杂的香气和口感。王嘉伟[47]在苹果酒发酵过程中同时接种乳酸菌与酵母菌进行共发酵，结果发现，乳酸菌与酵母菌共发酵能降低果酒总酸含量，增加果酒的柔和指数，口感和香气质量有明显提升。将乳酸菌与商业葡萄酒酵母同时接种发酵葡萄酒，通过测定活菌数、苹果酸和挥发性风味物质等来研究共发酵对葡萄酒质量的影响，结果显示葡萄酒的发酵周期缩短，发酵后由于丁二酸二乙酯和乳酸乙酯的生成使得葡萄酒具有黄油和奶油香味[48]。

4.3 微生物与葡萄酒陈酿

陈酿是某些葡萄酒最终风味的关键步骤。在使用橡木桶作为陈酿容器时，与木材有关的芳香物质会转移到葡萄酒中影响酒的风味。挥发性化合物主要是从橡木中提取的，如麝香木酚[49]。除了陈酿容器对葡萄酒品质的影响外，一些微生物衍生化合物，如多糖、游离氨基酸和肽，也可能对葡萄酒的成分产生影响[50-51]。这些化合物是从死亡酵母菌和细菌细胞中提取的，在分解过程中也能释放一些活性酶，在陈酿过程中不断改变葡萄酒的风味。因此，在葡萄酒陈酿过程中使用酒糟是一种改变葡萄酒成分的有效方式。酒糟陈酿在许多葡萄酒生产领域越来越受到重视[52]。然而，长时间的陈酿并不是没有变质的风险，因为耐乙醇物种的作用，如布鲁氏菌（Brettanomyces bruxellensis）可以产生大量的乙基酚，这是产生令人不快的酒香和药味的原因[53]。

5 展望

在葡萄酒传统酿造工艺中，普遍采用商业酿酒酵母参与葡萄酒发酵，不可避免地出现葡萄酒风味同质化现象。我国本土酵母资源丰富，在酿酒中使用本土酵母，可以体现葡萄酒的产区特色。但是对本土葡萄酿酒微生物的选育研究仍然没有全面展开，应用于工业发酵的本土酵母菌株少之甚少，因此加强本土酿酒酵母选育是未来研究的方向。酿酒师期望在陈酿过程中运用酒糟来改变葡萄酒的风味，这一新的尝试会提高葡萄酒品质，但是酒糟给葡萄酒带来的负面影响还应该深入研究。对于葡萄酒混菌发酵的研究多数还停留在混菌发酵对葡萄酒品质方面的影响，酵母菌与乳酸菌的混合发酵具有缩短发酵周期，降低总酸含量，改善葡萄酒香气等特点。发酵过程中有害物质产生的机理尚不明确，关于各个菌种之间的相互作用目前尚不清晰。未来，随着菌与菌之间的细胞生物学、生物化学、分子生物学等各方面研究的不断深入，结合蛋白组学、宏转录组学和代谢组学技术，有望揭示葡萄酒中各个微生物的交互作用及作用机理，为创制新型多样化葡萄酒奠定基础。