葡萄与葡萄酒中细胞壁的研究进展

高宇，袁华璐，缪榕，薛飞，宋士任，叶文秀，卢江*

（上海交通大学农业与生物学院葡萄与葡萄酒研究中心，上海 200240）

细胞壁作为植物细胞的一个重要组成部分，除能有效保护细胞的完整性外，还被发现参与生命体诸多活动，如控制细胞间物质运输、参与信号传导、逆境调控[1]。在葡萄的生长发育中，其果实的形成、膨大、成熟包含上百种酶参与了细胞壁的合成、修饰与降解途径。细胞壁的组分、结构对果实的质地口感起关键性作用[2]，而细胞壁内部大分子的结构修饰也会改变其与呈香物质、酚类物质的结合状态，从而进一步影响果实的品质[3]。成熟采收时的果实细胞壁状态很大程度上影响后续酿造工艺的选择与实施。因此，对葡萄果实细胞壁精确的组分与结构分析，是回答各种科学问题的前提。然而细胞壁结构的复杂性，各物种、品种、组织、发育阶段下的差异性也为检测带来很大的挑战。

细胞壁主要成分包括数十种单糖组成的纤维素、半纤维素、果胶、糖蛋白大分子等。而在每一重要组成成分下，由于主链、支链的细微差异，又含有诸多结构各异的大分子，如半乳糖醛酸聚糖、鼠李糖半乳酸醛酸聚糖、阿拉伯聚糖、阿拉伯糖木葡聚糖等。以往的研究逐步验证了其中部分大分子的特性和其对细胞壁结构特性和功能的潜在影响[4]。

1 细胞壁检测的历史、挑战与创新

细胞壁被公认为自然界最复杂的结构之一，由于分析技术的原因，对细胞壁层面上微妙复杂并且迅速变化的分析一直是个充满挑战的领域。细胞壁中的多糖不像基因与蛋白质一样被测序分析、合成并表达，因此，细胞壁分析技术的发展相对缓慢，一些传统技术（如气相色谱质谱分析单糖）直到今天还在应用。近年来，免疫生物学与检测设备的快速发展给细胞壁研究带来突破的契机，从不同角度提供高通量的检测数据，结合多元数据分析方法，为未来的研究提供了新的思路。以下简要总结细胞壁研究的主要检测技术以作比较。

1.1 色谱法

色谱法在葡萄细胞壁组分分析中有很长的历史，其中主要包括对单糖组分分析的气相色谱。细胞壁多糖主要包含7种中性糖：阿拉伯糖（Arabinose）、鼠李糖（Rhamnose）、木糖（Xylose）、甘露糖（Mannose）、岩藻糖（Fucose）、半乳糖（Galactose）、葡萄糖（Glucose），以及2种酸性糖：葡萄糖醛酸（Glucuronic acid）和半乳糖醛酸（Galacturonic acid），按照不同的键位形式连接而成。气相色谱在前数十年间被广泛用于葡萄果实成熟与葡萄酒酿造研究中，获得大量数据[5-7]。然而，由于多种多糖及糖蛋白大分子含有相同的单糖，直接从单糖数据反推多糖数据只能建立在以往的经验上，所获信息并不准确。另一方面，此技术的前处理步骤繁琐，需对多糖进行水解、衍生[8]，耗时耗力，不适用于大量样本。

除分析单糖外，液相色谱也被用于分离鉴定葡萄酒中的多糖成分，如研究人员通过利用体积排阻等多种液相色谱法，成功分离出红葡萄酒中的阿拉伯糖半乳糖蛋白、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖等多糖[9]，然而该技术耗时较长，分离效率低，且一些理化性质相近的分子不易分离[10]。薄层色谱是另一常用技术[11]，可根据不同分子在层析纸上的迁移速度分离一些结构相近（有无支链等）的分子（如寡聚糖），然而该技术在分离更复杂的大分子方面能力不足，近年来研究人员仍在不断改良这项技术[12]。

1.2 红外光谱分析

红外光谱技术利用物质对不同波长红外辐射的吸收特性，可有效区分具有不同官能团的多糖及糖蛋白大分子，在极短时间内对细胞壁样本进行上百次扫描，形成光谱图以作分析比较[13]。此技术灵敏度较高，不需对处

理好的细胞壁样本进行水解衍生步骤，是近年来研究细胞壁多糖的关键方法之一。Kacuráková等[14]针对果胶以及半纤维素的不同多糖成分，确定了细胞壁各种多糖特征的光谱形状和红外光谱波数。红外光谱产生的大量原始数据（不同波数的吸光度）可以运用多元数据分析方法来比较样品间光谱的差异，定位造成差异的关键波数和与之对应的多糖大分子，近年来在葡萄与酵母细胞壁的研究中均有所应用[15-16]。然而，由于一些官能团（如羟基等）存在于结构相似的数种多糖（如果胶中的半乳糖醛酸聚糖和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖）中，因此红外光谱的一些波数仍无法较精确的区分果胶、半纤维素级别以下的多糖分子，一般需要单糖数据进行共同分析[15]。

1.3 多糖抗体芯片分析技术

随着免疫生物学的发展，精准识别各种多糖大分子结构的单克隆抗体被不断研发合成（主要来自英国利兹大学、法国INRA以及美国乔治亚大学）[17-19]。这些抗体可精准区分相似结构的多糖，如高甲酯化果胶、低甲酯化果胶与无甲酯化果胶均有相应的单克隆抗体。多糖单克隆抗体的产生，结合植物组织切片的显微镜观察，直观而深入的展示了植物生长发育过程中的细胞结构变化。然而，多糖抗体造价昂贵，而且为了更清晰准确的观察，在植物切片显微镜观察中通常只能运用一到两种抗体（结合不同颜色的指示剂），无法获得更为完整的细胞壁信息。近年来，高通量多糖芯片技术的问世推动了多糖抗体的高效运用，此技术可同时将数百种用以比较的样本（或处理）的细胞壁提取物高密度打印来制作芯片（2 cm×2 cm），极少的样品量（5毫克细胞壁样本）可制作上百张芯片，这些芯片可分别与数十种所需的单克隆抗体（用量微量）进行亲和反应，最终形成大量亲和度数据，用以构建热图或多元数据分析[20]。此技术自2007年诞生来，在烟草叶片细胞壁半纤维素的精细修饰、葡萄成熟过程中多糖大分子结构调控的品种间差异等相关领域研究中已经得到广泛的应用[21-23]，Wood等[26]将多糖抗体技术与转录组数据相结合，提出该技术有利于辅助挖掘植物发育中关键结构标记物，拓展了其未来的应用。

2 细胞壁在葡萄与葡萄酒中的研究热点

分析技术的发展也帮助我们在葡萄与葡萄酒相关的细胞壁研究不断深入，从结构层面上逐步明晰了以往一些无法解释的现象。以下从葡萄果实发育、葡萄酒酿造、葡萄酒品质与稳定三个方面简要介绍近年来的细胞壁研究进展。

2.1 果实发育成熟中的细胞壁合成、修饰与降解

传统的果实发育成熟研究通常关注糖、有机酸以及酚类化合物含量变化，而细胞壁对后续葡萄酒酿造的特殊性也使其成为重要的关注点之一。前期研究人员运用显微镜发现果肉细胞在成熟过程中完整性的变化，但并不能更深入获得更多细胞壁的组分信息。因此更多的研究集中在运用气相色谱分析果实细胞壁在葡萄成熟过程中各阶段的单糖组分变化，尝试挖掘除糖酸之外的结构标记物。一些分析发现，成熟过程中较为显著的变化为半乳糖比例的降低[27]，这可能与细胞壁中半乳聚糖与I型阿拉伯半乳聚糖的降解相关，之后研究发现的β-半乳糖苷酶mRNA在转色期的累积与成熟期的酶活性数据都进一步支持这一推论。成熟期内细胞壁果胶相关结构的变化也是一个显著的特征，相关的数据不断证实果胶的修饰降解是一个多酶参与精细调控的过程，目前已知的包括α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、果胶甲酯酶、果胶脱乙酰酶、果胶裂解酶、半乳糖醛酸聚糖酶等[27]。与其他水果相比，葡萄果皮中的果胶甲酯率在成熟过程中下降幅度相对较小（从58%降至48%）。 细胞壁其他成分的改变包括细胞壁蛋白含量的提高和纤维素、半纤维素含量的相对恒定[22]，而这些变化在后期的研究中被发现在不同葡萄品种间具有差异。如欧美杂交后代（Vitis vinifera×Vitis labrusca）显示其细胞壁纤维素含量的降低与半纤维素中木葡聚糖的解构[28]，而欧亚种中‘霞多丽’品种成熟期木葡聚糖相关修饰/水解酶的表达也显现出相似的表型结果[29]。另一项研究对比了欧亚种4个品种，发现‘慕合怀特’（Mourvedre），‘美乐’与‘赤霞珠’果肉中半乳聚糖含量、果胶甲酯化与乙酰化程度的降低，但这些变化都没有在‘西拉’中出现[30]。多糖抗体芯片技术也在近期在葡萄成熟研究上有所应用，所获结果不但印证了前期的单糖数据，并且更直观快速的提供了有价值的新信息，如‘赤霞珠’成熟过程中细胞壁中识别高甲酯化果胶抗体与识别低甲酯化果胶抗体亲和度的比值变化，而识别无支链木葡聚糖的抗体亲和度降低，有支链木葡聚糖抗体亲和度不变也更精确展现出半纤维素内部的精细修饰[22]，该研究人员还将‘赤霞珠’与鲜食葡萄‘克瑞森无核’进行从转色期前至成熟阶段的比较，两品种显示出差异较大的细胞壁修饰途径。除品种差异外，同一品种也会受各种因素影响导致细胞壁结构状态的变化，如对同一块葡萄园内不同区域的成熟‘赤霞珠’进行细胞壁多糖的检测后，发现其果胶的降解程度并非处于同一阶段，尽管后期的酶浸渍在一定程度上降低了这些差异[31]。另一针对‘西拉’品种的果实脱水皱缩现象的细胞壁研究发现，相同糖度的皱缩果实与非皱缩果实间细胞壁各组分结构具有相当大的差异（未发表数据），这些差异也不可避免的将会对接下来的葡萄酒酿造造成影响。

2.2 酿造中葡萄细胞壁降解过程优化

在葡萄酒生产中，对葡萄果实的破碎可有效释放出果肉中的糖和有机酸。然而，为达到高品质的葡萄酒，浸皮这一步骤是不可或缺的（特别是红葡萄酒）。这是因为决定红葡萄酒品质的物质（如花青素、单宁等）主要富集在细胞密集紧致，对机械破碎具有高耐受力的果皮中，因此对果皮细胞壁的有效降解是浸皮过程中的重中之重[32]。为提高浸皮效率，前数十年间研究人员对酿造工艺进行了多种方法的尝试，包括对温度的调控，如发酵前低温浸渍、发酵后升温等，添加微生物粗提物制备的果胶酶（混合酶制剂），以及尝试运用一些辅助设备，如超声波、脉冲电场等[33]。类似研究持续至今的原因是这些技术的不稳定性，甚至一些研究发现这些手段对某些品种的成酒品质影响微乎其微，或正面效应难以稳定，年份间、品种间、批次间的差异一直存在[34-35]。添加果胶酶虽然被广泛应用于酿酒中，也被认为是相对最优的选择，但产品间的差异，具体活性信息的缺失和可能存在的负面影响都依然存在。造成这一现象的关键因素是缺乏葡萄细胞壁的结构数据，以及其在酿造环境下的动态变化的观测手段，导致我们对葡萄细胞壁的酶促打击无法精准实施。如同果实成熟研究，前期研究人员对葡萄细胞壁在酿造中的变化相关研究也主要通过单糖分析手段[7]。由于品种间的差异，相关研究主要集中在一些酚类物质提取难度较高的品种，如西班牙研究人员对‘慕合怀特’的细胞壁结构以及各种工艺对其降解的影响进行了多年的研究[7,34,36]。针对其他品种的研究也一直在持续，然而，如同上文所言，传统技术奠定了重要的数据基础，但其缺陷也限制了我们进一步探究更准确的细胞壁结构信息。近年来，Gao等[37]首次运用高通量多糖抗体芯片的手段结合化学和酶促分馏技术，研究发酵过程中细胞壁成分的变化以及多糖的降解途径。通过观察各个馏分的多糖含量及构成，证实‘赤霞珠’果皮细胞壁含有丰富的果胶层，果胶的网络结构由紧密结合

且高度甲酯化的半乳糖醛酸聚糖和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I型（RGI）组成，并推测出可能的支链结构。而浸渍过程中浆果中的果胶成分发生了明显的去酯化和降解反应，最终皮渣以半纤维素结合RGI与糖蛋白等细胞壁组分为主。随后该研究小组在此基础上，设计不同的重组果胶酶组合，利用细胞壁分析技术跟踪细胞壁结构的变化，结合前人关于细胞壁多糖组分间的链接关系，首次构建‘赤霞珠’果皮细胞壁的假想模型，提出‘赤霞珠’果皮细胞壁主要包含两层构造，分别富含半纤维素和果胶，通过阿拉伯糖半乳糖蛋白（AGP）和延伸蛋白相互交联。半纤维素内核被多层高度酯化的富含同型半乳糖醛酸与RGI的果胶所紧密包裹。而外围较为疏松的果胶层主要含有低甲酯化的半乳糖醛酸聚糖和带有支链的Ⅰ型鼠李糖半乳糖醛酸，支链多以阿拉伯聚糖为主，也连接一些细胞壁蛋白，比如AGP[39]。根据假想结构，研究人员指出果胶裂解酶可能在降解‘赤霞珠’果皮细胞壁、释放酚类物质上起到核心的作用。鉴于品种间的细胞壁结构差异性以及各自追求的风格特点，未来仍需要对各主栽品种进行针对性的研究。

2.3 细胞壁多糖与葡萄酒品质

由于在葡萄酒澄清与稳定方面的潜在作用，细胞壁对多酚物质的吸附机制也逐渐引起研究人员的重视。研究发现，原花青素与碳水化合物的亲和度由强到弱依次为果胶、木葡聚糖、淀粉、木质纤维素[39]，而它们之间的亲和度也与双方组分、构象相关。如单宁的聚合程度、果胶的甲酯化程度与亲和度呈正相关。而葡萄成熟过程中，特别是后期果胶与单宁的亲和度上升造成萃取量下降，则被认为是成熟后期果胶结构疏松，空隙增大造成的构象变化增加单宁的附着点[39]。因此，运用酿造后果胶疏松的皮渣来进行过量单宁的吸附，降低葡萄酒的涩感和不稳定因素（沉淀），被认为是一种可行的方法。另外，酒泥对葡萄酒酚类物质的吸附作用也被认为是酒泥中高含量的细胞壁糖蛋白、酵母细胞壁糖蛋白（主要为甘露糖蛋白Mannoprotein）与原花青素的高亲和力相关。近期的研究运用高通量多糖抗体技术对酒泥的多糖组分进行了较为全面的分析，并对比了果胶酶对酒泥组分的影响[40]。

研究人员发现，在浸皮过程中，葡萄细胞壁在一系列果胶酶作用下的松动破裂除了提高了花青素、单宁等有益成分的萃取程度，也会向葡萄酒释放出较小分子量的可溶的细胞壁多糖及糖蛋白分子，近年来这些分子被逐渐认为是影响葡萄酒品质的重要因素[41]。通过前期气相色谱单糖分析，研究人员认为酒中含有的可溶性多糖成分主要包括半乳糖醛酸寡聚糖、RGI型与RGII型、阿拉伯聚糖、含阿拉伯糖支链的半乳聚糖、AGP等[9]。前期的研究工作指出，这些大分子可能对葡萄酒的生产与最终质量起到不同的影响，如AGP可降低葡萄酒的过滤难度[42]，来自酵母的甘露糖蛋白可降低白葡萄酒出现浑浊的可能[43]，RGI型与RGII型可延缓酒石酸结晶的形成[44]。然而，这些工作往往是针对某一种多糖，并且有些工作是在模拟酒溶液中进行，忽视了葡萄酒是一个更为复杂的体系，各种多糖大分子的存在，以及含量、相关作用可能给葡萄酒带来更为综合的影响。因此，将更为全面的可溶多糖数据与葡萄酒生产与品质相关联能够给我们提供更有价值的数据。近期，Gao等[37]尝试对浓缩后的葡萄酒进行低温乙醇沉淀与多糖成分提取，通过多糖抗体芯片技术得到‘赤霞珠’葡萄酒中较为全面的可溶性多糖组成数据。而Fangel等[45]进一步运用啤酒原酒本身作为多糖提取物，制作成多糖芯片并进行抗体检测，较为清晰的区分出了酿造工艺对啤酒中多糖组分与含量的影响[45]，值得在葡萄酒多糖的研究中借鉴。

3 问题与展望

综上所述，细胞壁是葡萄与葡萄酒学科中一个重要的研究领域。研究人员通过以往数十年的研究积累了大量的数据，初步明晰了细胞壁与葡萄果实生长发育、葡萄酒的生产与品质的提高具有很大的相关性。目前，世界葡萄酒产业已经逐步向精细化、个性化、定制化发展，如何在未来使葡萄酒的生产变得更为可控，从而突出品种优势，彰显产区特色，是我国葡萄酒产业发展的一个重要挑战。而为应对这一挑战，需要葡萄与葡萄酒各领域的研究人员共同就各产区提出更为针对性的关键问题。在葡萄细胞壁相关的研究上，目前有以下一些重要问题亟待解答：（1）如何针对不同葡萄品种间果实细胞壁存在的差异而设计更具针对性的酿造工艺，从而突出品种特色；（2）受气候影响，我国不同产区的同一品种在同一成熟度下的果实细胞壁状态是否存在差异，这种差异如何影响葡萄酒的生产与质量；（3）如何根据细胞壁结构数据设计工艺（如果胶酶的组成和比例），来平衡果实中有益物质的萃取程度和葡萄酒的最终品质；（4）葡萄酒中微生物（如酿酒酵母、野生酵母）是否能释放细胞壁降解酶，这些酶如何影响葡萄果实细胞壁降解；（5）葡萄酒中可溶性多糖的组成、比例、互作与葡萄酒品质（香气、口感、稳定等）间存在怎样的关系。近年来检测技术的飞速发展，为细胞壁精细结构的全面深入分析创造了条件，将会不断拓宽我们对葡萄果实细胞壁合成、修饰、降解机制与葡萄酒生产中多糖动态过程监测的探索途径，逐步明晰细胞壁及其内部成分在整个葡萄与葡萄酒生产过程中所担任的角色与变化规律，为未来针对我国产区与主栽品种设计更为可控的栽培与酿造工艺提供关键数据。