稳定同位素在葡萄酒产地溯源中的研究进展

申雪，袁玉伟，聂晶，王伟雄，黄翠，武运*

（1. 新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2. 浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，浙江杭州 310021）

葡萄酒是由破碎或未破碎的新鲜葡萄果实或葡萄汁通过发酵后获得的低酒精类饮品。葡萄酒中含有多种活性成分，长期少量饮用可降低血液中的低密度胆固醇，有益于人体健康[1-2]，因此深受各国人民的喜爱。目前我国葡萄酒生产基地已渐渐形成规模。随着国民生活质量的提高，消费者对葡萄酒的品质和产地也越发重视。葡萄酒的商业价值主要来源于产地和葡萄酒酿造生产的年份。然而，近年来葡萄酒的掺假、地理产地误标等时常发生，严重扰乱了市场秩序，不仅造成企业的严重损失，也为政府监管带来困扰。因此，葡萄酒的真实性信息受到了社会的广泛关注，葡萄酒的产地溯源已经变得不可或缺[3-4]。

目前，应用于食品产地溯源的技术有稳定性同位素分析、电子信息编码技术、矿物元素分析、有机成分分析和 DNA 指纹分析等方法，其中稳定性同位素组成作为食品的天然指纹，与农产品生长的地理环境密切相关，既不会遭受人为改变，也不会受外源化学物质的影响，能反应农产品所处的环境条件，提供可靠、准确的食品产地来源信息，已广泛用于鉴别不同产地的各种农产品[5]，其中有些同位素分析方法已得到美国官方分析化学师协会（AOAC）及标准化委员会（CEN）的承认[6]。本文主要介绍稳定同位素的基本原理以及常用的几种稳定同位素在葡萄产地溯源中的变化机理和研究现状，旨在推动稳定同位素在葡萄酒产地溯源中的研究与应用，促进葡萄酒产地追溯制度的建立与完善。

1 稳定同位素技术概况

同位素技术是基于原子性质所衍生的一种方法。同位素是具有相同原子序数的不同原子，其差异来源于中子数目的不同，质量差异较小。稳定同位素是指半衰期大于1015年的元素同位素。因具有相同原子序数，同位素的化学性质几乎相同。研究元素的同位素组成是稳定同位素分析技术的核心[7]，利用其同位素进行溯源的基本原理是依据稳定同位素的自然分馏效应。因质量和核自旋的差异会导致反应产物的同位素组成与原始的同位素组成不同，这种差异称为同位素效应或分馏。由于不同地区的大气、土壤、水等环境中的同位素组成具有差异，加上生物体内的同位素受到代谢等因素的影响，导致同位素组成产生差异，利用这种差异可以区分可能的地理来源[8-9]。稳定同位素组成可以通过稳定同位素质谱仪进行测定，并根据国际标准以同位素比值（δ值）形式进行表示，该值乘以1000以千分数（‰）为单位。稳定同位素分析技术是较早对农产品进行地理溯源的方法之一，国内起步较晚，基础也较薄弱。但是随着我国科技发展和仪器的不断更新，稳定同位素质谱为溯源领域的研究提供了极大的便利。

2 常用稳定同位素在产地溯源中的特征

地理来源的确定通常需要多个稳定同位素参数。这应包括氢、碳、氮、氧和硫（构成生物材料的轻元素，即所谓的“生物元素”）的稳定同位素数据，有时还包括重元素，如锶、铅等同位素比值[10-11]。较重的元素或“地球元素”是生物体中不必要的或至少在数量上不重要的组成部分，它们也没有被积极地整合到生物分子中，因此不受生物系统中可测量的同位素分馏的影响。然而，它们可能是当地地质（岩石、土壤）的非常重要的指标，生物物质来源于此，也可能表明人为污染。稳定同位素分析技术的应用是基于这些元素的稳定同位素比值随产地的地理来源、气候条件、土壤学和地质条件的变化而变化[12]。

2.1 碳同位素

碳是重要的生命元素，自然界中有两种稳定碳同位素分别是12C和13C，在大自然中的占比分别为98.89%、1.11%。植物中δ13C值范围因不同光途径合成的碳水化合物而不同，目前存在3种光代谢途径，分别是C3途径（Calvin循环），C4途径（Hatch-Slack循环）和CAM途径。C3植物的δ13C范围为-3%～-2.3%，C4植物的范围为-1.4%～-1.2%，CAM植物存在C3和C4途径，其δ13C范围为-2.8%～-1.5%，因此在不同植物中δ13C值能够反应植物的生长方式和生理生态过程。δ13C是农产品产地判别的良好指标[13-14]，张遴等[15]通过测定苹果和苹果汁中的稳定同位素发现，δ13C不会由于苹果加工而改变，同时也不会随着时间的变化而改变，因此δ13C具有较好的稳定性。黄岛平等[16]通过对广西、湖南、四川、福建4地柑橘中的δ13C进行检测发现，各地柑橘果汁中的δ13C数据显著不同。吴浩等[17]通过建立葡萄酒中5种挥发性组分碳稳定同位素比值新方法，研究了法国、澳大利亚、美国和中国共54个样品，发现此方法对4个产区的葡萄酒能进行有效区分，并能应用于鉴别葡萄酒是否造假。

2.2 氢和氧同位素

氢和氧是自然界中两种主要元素，他们以单质和化合物的形式遍布全球。水中氢氧同位素组成对生态学研究具有重要意义，是预测气候变化、构建古气候的重要目标参数。大气降水中的氢氧同位素（称为降水同位素）及分布规律受蒸发和凝结作用制约，目前国际上已有多年多地的降水同位素景观图谱，存在温度效应、纬度效应、海拔效应、大陆效应、降水量效应和季节性效应[18-19]。植物干物质中的氢同位素不仅受降水同位素的影响，也会受植物的蒸腾作用所影响；然而，氧同位素受植物的光合作用以及呼吸作用中的同位素分馏而影响。因此，不同产区中农产品的氢氧同位素会有不同的表现[20-21]。Dutra等[22]采集巴西南部的3个不同区域的酿酒葡萄与葡萄酒，研究发现将葡萄中的18O/16O与矿物质元素结合能够更好的加以区分。West等[23]通过CO2平衡方法研究欧洲等地的葡萄酒中δ18O与空间气候和降水δ18O模式之间的关系，并开发在GIS空间上的回归模型，结果发现葡萄酒水中的δ18O记录了酿酒葡萄成熟后期以及气候中的δ18O，表明葡萄酒水中δ18O地理信息系统模型是独立验证葡萄酒产地和年份的有效工具。

2.3 氮同位素

氮元素最丰富的形式是大气中的氮气（N2），它的结构稳定，化学性质不活泼，常温下很难与其他物质发生反应，因此大多数的生物都无法利用，也使得氮成为一种限制性的营养元素。自然界中有两种方式能将惰性的氮变为活性的氮，一是自然放电过程使得氮气转化为氮氧化物，二是通过生物固氮菌将空气中的氮变为还原性氮化合物——氨[24-25]。自然界氮素的循环中，能被生物利用的氮离不开土壤的环境，大量的研究集中在植物与土壤中氮的转化及影响因素。农产品中氮同位素的影响主要与农业施肥相关，人工合成化肥中δ15N比较贫化，如果土壤得不到足够的氮素以弥补损失，含氮量就会下降，从而影响农作物生长。施肥（包括化学肥料和农家肥）和生物固氮是补充土壤中氮素的方法[26]。Francesco等[27]通过对不同产区中有机与非有机鲜食葡萄的研究发现，当δ13C、δ18O 和δ2H稳定同位素与适当的化学计量法相结合，可以很好的对葡萄产地进行判别（预测能力为92.2%），然而，利用稳定氮同位素在鲜食葡萄的产地判别中的效果并不明显。

2.4 铅同位素

铅同位素一般以207Pb/206Pb和208Pb/207Pb作为检测指标。植源性农产品中的铅金属主要来源于土壤及地表水，由于不同产区的地质结构和地质年龄存在差异，并且各个地区的降水分布不同，导致铅同位素含量也有所不同，故铅同位素的组成因此具有显著的地区差异，可以用作为植源性农产品产地判别的标识。但由于很多企业的生产工艺及设备材质的不同也会对铅同位素的含量产生影响，而铅稳定同位素的优点在于能够追溯出可能的铅来源及传播途径，并且样品用量较少。因此，目前铅同位素在溯源技术的研究多集中于环境中铅污染的来源上[28-29]。

2.5 锶同位素

锶同位素是一个强大的地理标志，常用87Sr/86Sr表示。不同产地的植源性农产品由于不同的地质环境、气候差异以及季节的影响，87Sr/86Sr的含量都也会有所不同。但由于87Sr/86Sr属于重同位素，在植物和化学过程中不会发生明显的分馏现象。87Sr/86Sr比值的主要影响因素是植源性农产品种植的地理环境和岩石结构，几乎不受季节交替和气候温度的影响。因此当植物产品中δ18O和δ2H不易判别时，同时在气候差异较小的地区，采用锶稳定同位素来进行产地溯源可以获得比较理想的效果[30]。

3 稳定同位素在葡萄酒产地溯源中的应用

目前，葡萄酒产地溯源主要有4种方法：一是矿物质元素指纹分析；二是芳香物质组成分析；三是红外检测；四是稳定同位素技术。稳定同位素分析技术是欧洲和北美官方承认所使用的鉴别农产品地理来源的方法，葡萄酒中的轻稳定同位素以13C/12C、18O/16O、2H/1H为主，测定指标主要是葡萄酒乙醇中的δ13C、D/H和水中的δ18O。轻稳定同位素分馏的大小受区域差异及参数变化（如湿度、温度、风等气象条件）等因素的影响，因此这些稳定同位素的比例可以提供有关植物和地理起源的信息，重稳定同位素不会因为化学或生物过程而发生同位素分馏作用，酿酒过程一般不会对葡萄酒中的重同位素比值产生影响[31]。

3.1 轻稳定同位素

轻元素氢、碳、氧比值的测量被证明是溯源应用领域中特别有用的指纹工具[32]，不同产地的酿酒葡萄由于生长环境的不同引起葡萄酒乙醇中的稳定碳同位素差异[32-34]。高湿、高温地区的葡萄所酿造的葡萄酒中乙醇13C的数量远高于干燥、寒冷地区，因此，气候中温度与湿度两个因子对于酿酒葡萄具有重要的影响[35-36]。Zyakun等[37]通过利用同位素质谱法对西欧和俄罗斯两个不同产区的酿酒葡萄中的营养部位（根、枝条、叶子）和生成部位（浆果）进行研究，结果表明植物组织和浆果中δ13C值的变化与植物生长中的水分（年降水量之和）和温度（年有效温度之和）有关。因此，以葡萄原料生产的乙醇中的δ13C同位素含量取决于不同品种以及生长环境的水分含量。Camin等[38]考察意大利11年间各地生产约4000个葡萄酒样品，这是第一个将葡萄酒中碳、氢和氧同位素和环境变量关系结合起来的全面研究。该研究利用可视化工具、回归分析和线性模型调查葡萄成熟日期、经纬度、与海洋的距离、降水量、最高和最低日均气温、全年平均气温、降水同位素与葡萄酒中同位素的关系，并定义了气候和地理数据推断同位素值的多元模型。研究特别强调了葡萄酒水中的δ18O与气候和地理位置的关系最强，其次为干湿度，主导变量为纬度，呈负相关；降水量和温度的δ18O和δ2H均呈正相关。江伟等[39]对河北昌黎、山东蓬莱、宁夏贺兰山东麓和河北沙城4大产区的60个样品中的碳、氢、氧同位素进行研究发现，虽然样品范围分布广泛，但同一地区较为集中，故单一使用碳、氢、氧任何一种元素都无法有效区分产区。当结合3种元素并采用线性判别分析能100%判别4大产区的葡萄酒。

3.2 重稳定同位素

在过去几十年中，越来越多具有地质意义的重稳定同位素比值被用于考古、环境、医学以及鉴别食品原产地等领域[46]，葡萄园的每个地质层都含有其自身的重同位素成分。葡萄酒中的铅与大分子有关，主要是单宁、多糖和蛋白质片段；红葡萄酒经过消化后，只有不到20%的铅以可吸收的形式存在[40-41]。葡萄酒中的铅可能来自两种污染源，一种是天然的，与土壤有关；另一种是人类活动造成的。后者与农药、生产、运输和用于储存葡萄酒的材料以及先前工业和运输排放的铅在大气中的沉淀有关。有学者通过采集葡萄酒生产时所用到的葡萄以及种植土壤和空气，检测发现铅同位素比值的变化可以用来追溯铅污染的来源[42]。Medina等[45]指出，葡萄枝条也可能吸收来自大气环境中的铅，并发现植物从沉积物中吸收的铅是低于大气中的，因此证明铅同位素可以用于葡萄酒中铅污染的来源判别。Dean等[44]通过测量澳大利亚和欧洲葡萄酒中的铅同位素发现，不同产区葡萄酒中铅同位素组成不同。葡萄酒中的87Sr/86Sr同位素比率反映了葡萄生长的土壤状况，也是葡萄酒地理来源的有效指标，运用87Sr/86Sr在跟踪葡萄酒原产地方面的应用是地质性同位素最具有开阔性的应用之一[45]。Horn等[46]对不同国家葡萄酒的87Sr/86Sr比值测定后发现，不同产地中葡萄酒的87Sr/86Sr比值不同，并且一些样品标签可能存在产地误标等现象。87Sr/86Sr在酿酒期间产生变化可能是由于在发酵过程中果皮与种子中的87Sr/86Sr被释放出来，Fernandes等[47]对葡萄牙不同地区葡萄酒中的87Sr/86Sr进行测定，发现不同产地的葡萄酒中的87Sr/86Sr比值存在明显不同，虽然有研究表明在酿造过程中87Sr/86Sr会产生变化，但锶同位素仍是葡萄酒示踪的重要指标，并在2018年，该学者对不同葡萄酒发酵全过程中的δ87Sr/86Sr进行测量，并发现δ87Sr/86Sr值在种植土壤、葡萄汁和葡萄酒中具有统计学上的一致性，表明δ87Sr/86Sr是研究葡萄酒起源中非常有价值的指纹[48]。如Marchionni等[49]利用TIMS测定6个不同农场的岩石、土壤、葡萄、葡萄汁和葡萄酒中的87Sr/86Sr，研究发现87Sr/86Sr不会随着时间的推移而改变，而是独立于酿酒程序和年份。葡萄酒从葡萄园土壤中继承锶同位素组成，使87Sr/86Sr成为评估地理种源问题真实可靠和技术先进的科学工具的首要候选。并且有数据显示葡萄酒的同位素特征与土壤的生物可利用率密切相关，而与土壤的体积无关。

4 总结与展望

稳定同位素用于葡萄酒产地溯源是基于同位素分馏原理所发展的一项新技术，欧盟已利用该技术在众多葡萄酒及农产品中进行有效的产地溯源研究，证明该方法的有效性，并且利用稳定同位素是一种直接、有效且影响因素较少的方法。稳定同位素会受环境和气候的影响，从而在不同产地之间表现出差异性，对葡萄酒产地形成有力的保护，有效维护葡萄酒市场，同时间接增加经营者的经济收入，提高葡萄酒消费经济效益。为了更好的进行有效产地溯源，将其与统计学中的分析方法（主成分分析、方差分析、聚类分析等）进行结合，对维护葡萄酒市场秩序、确保生产者公平竞争、增强消费者对葡萄酒行业的信心并保护消费者利益具有重要意义。