拮抗尖镰孢菌的生物防治试剂的分离与鉴定

郑宝胜 葛敬如 苏昕（通讯作者）

（沈阳药科大学 辽宁 沈阳 110016）

植物枯萎病是由寄生的尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）引起的真菌性传染性疾病，尖孢镰刀菌通过产生出有毒物质镰刀菌素扩散导致病株叶片枯黄而死[1]。由于农业防治的局限性和传统的化学防治容易残留农药，对人体有危害和污染环境，基于微生物及其代谢产物的生物防治方法已经成为全球植物病害防治的主要发展方向[2]。因此，研究微生物及其活性物质能够有效地帮助开发新型农药，同时也是阐明其作用机理的重要环节。作为菌株的生物防治机制之一，水解酶越来越多地被用作评估生物防治细菌生物防治潜力的指标[3-4]。芽孢杆菌可以产生多种抗菌物质，但当芽孢杆菌被用作控制植物病原菌的微生物制剂时，抗菌作用的发挥主要是由于其产生脂肽类抗生素[5]。本实验旨在通过测定芽孢杆菌的水解酶活性和解磷能力评价其生防价值，并对芽孢杆菌次级代谢产物进行抑菌跟踪测定，从而初步研究其抑菌机制。

1.材料

1.1 主要材料

尖刀镰孢菌（Fusarium oxysparm)——沈阳农业大学；

芽孢杆菌（Bacillus siamensis）X13——沈阳药科大学。

1.2 主要培养基

沙氏培养基

牛肉膏蛋白胨培养基（NB 培养基）；

土豆-蔗糖琼脂（PDA）培养基；

胞外酶活性测定基础培养基；

琼脂粉——天津市科密欧化学试剂有限公司；

蒸馏水——沈阳药科大学；

生理盐水——0.85%生理盐水；

染色剂——卢戈氏碘液；0.1%刚果红染液。

1.3 主要设备

台式离心机：上海安亭科学仪器厂；

立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；

HZQ-QX 全温振荡器；

RE52-99 旋转蒸发仪。

2.方法

2.1 蛋白酶，淀粉酶和纤维素酶活性的测定

将X13 分别接种在蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶培养基平板上，经培养后观察是否有透明圈产生，测量透明圈和菌落直径；按以下公式分别计算出三种酶活性：

酶活性=透明圈直径/菌落直径

2.2 解磷能力测定

将X13 菌株加入NB 培养基中于37℃摇培24 小时，用作种子溶液。将菌液分别接种于NBRIP 无机磷固体培养基和有机磷固体培养基上，置于37℃培养箱中培养4 天，观察有无解磷透明圈。根据是否有解磷圈来确定其对无机磷和有机磷的解磷作用。

2.3 X13 菌发酵液的制备

将菌株X13 在37℃接种到种子培养基(同发酵培养基成分)中，作为种子液以180r/min 培养24 小时。将种子液以5%接种量接种到发酵培养基中，然后置于37℃的摇床中，以180r/min 培养48 小时。

2.3.1 脂肽粗提物的制备 （1）调节发酵液pH 到8.0，使脂肽尽量多地溶解在发酵液中，并在室温下以3500r/min 离心45min；（2）取上清液，调节pH 到 2.0，并在4℃下静置12 小时，在室温下以3500r/min 离心45min，上清液经拮抗实验验证，没有抑菌活性，抑真菌活性物质主要留存在沉淀中，因此弃去上清液；（3）用pH 为2.0 的盐酸洗涤沉淀两次，再以甲醇少量多次萃取(萃取3 次)；（4）萃取液于30℃减压蒸干溶剂，得到的淡黄色粉末即为脂肽粗提物，溶解在甲醇中，使其终浓度为5 g/L 左右，避光保存于ep 管中。

2.3.2 脂肽粗提物的抑菌活性跟踪测定 （1）制备单孢子悬液：取尖镰孢菌斜面，加入5ml 无菌生理盐水，刮下菌苔，倒入含有玻璃珠的100ml 灭菌三角瓶中，振荡20 min，将孢子分散并活化，用过滤装置进行过滤，得到单孢子悬液，备用。（2）制备混菌平板：将灭菌后的PDA 培养基倒入无菌培养皿中，每个平板15mL 左右。吸取尖镰孢菌孢子悬液150uL，加入到装有50 mL 已灭好菌且温度冷却到55℃以下PDA 培养基的锥形瓶中，摇匀倒入已浅浅凝固一层PDA 培养基的无菌培养皿中，静置冷却成混菌平板，备用。（3）滤纸片法测定脂肽粗提物的抗菌活性：将待测脂肽粗提物溶于甲醇中，使其浓度为5mg/ml，将直径为6mm 的无菌滤纸片加入培养基中，并将10μL 待测脂肽粗提物逐滴添加到滤纸片上，以等量纯甲醇作为对照。将平板置于28°C 温育5 天，观察且记录下抑菌状况。

3.结果

酶活性= 透明圈直径/ 菌落直径，蛋白酶活性：30.2mm/7.6mm=3.97；淀粉酶活性：12.5mm/9.1mm=1.37；纤维素酶活性：29.5mm/7.1mm=4.15。三种水解酶均有活性，纤维素酶活性最高，蛋白酶其次，淀粉酶最低。无机磷细菌培养基：X13 菌落边缘出现轻微透明圈，因此有轻微的解无机磷作用。有机磷培养基：X13 菌落周围无透明圈产生。滤纸片法测定脂肽粗提物的抑菌圈直径约32.0mm，而甲醇对照组则无抑菌活性。活性跟踪测定实验结果表明，脂肽粗提物对于尖镰孢菌具有良好的抑菌活性。

4.结论与讨论

（1）菌株X13 可产生蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶，具有较强的生物防治潜力和生物防治价值；（2）菌株X13 具有解无机磷能力，未表现出解有机磷能力；（3）菌株X13 的脂肽粗提物具有明显的抑菌活性，可拮抗尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。通过本次实验测定芽孢杆菌具有水解酶活性和降解无机磷能力，及其次级代谢产物脂肽粗提物具有较强的抑菌活性，但脂肽粗提物中主要抑菌物质还有待进一步分离、纯化及鉴定。