牡丹花粉生活力测定方法及其贮藏研究进展

李 婷， 乔 琦， 李剑峰， 郭幸飞， 侯小改

(河南科技大学 农学院/牡丹学院，河南 洛阳 471023)

牡丹(Paeoniasuffruticosa)系毛茛科芍药属多年生木本植物，原产于中国，有极高的观赏价值和药用价值，因其栽培历史悠久，品种繁多，素有“花中之王”“国色天香”之美誉。牡丹根皮又称牡丹皮、丹皮，是一味应用广泛的传统中药。近年发现，牡丹籽油中包含大量有益人类身体健康的微量元素、高浓度脂肪酸和牡丹黄酮等物质，可广泛应用于保健产品、化妆品、饮料及食用油等不同领域[1]。随着牡丹籽油应用价值的发现，其籽粒的需求量日益增加。但我国油用牡丹普遍表现结实率低，进而严重影响籽粒产量。我国油用牡丹主栽品种之一凤丹(PaeoniaostiiFeng dan)，其不仅结实率较低，且广适性较差，仅分布于我国少数地区，迫切需要提高籽粒产量及其适应性。前人对牡丹的相关研究大部分集中在施肥、杂草防控和病虫害防治方面，在一定程度上提高了牡丹籽粒的产量[2]。杂交育种是提高牡丹结实率和适应性的有效手段，但杂交过程中最大的问题是花期不遇，因为牡丹花期短且集中，不同品种同花期的较少，而通过花粉贮藏可以有效解决花期不遇问题。准确测定牡丹花粉活力可快速找出高效亲本，缩短育种年限，从而加快育种改良速率。鉴于此，从牡丹花粉的采集、花粉活力的测定和花粉贮藏等方面进行概述，分析影响牡丹花粉萌发和贮藏寿命的因素，并提出下一步牡丹花粉贮藏研究的方向，以期为同类研究及牡丹杂交育种提供参考。

1 牡丹花粉的采集

1.1 采集时间

花粉的采集时间是影响花粉活力的重要因素[3]，根据具体的花蕾发育形态和色泽变化特点及时采集花粉，采集过早，则雄蕊未完全成熟，花粉量少且积累的营养物质不足，造成花粉活力低下；采集过迟，大部分雄蕊已散粉，影响花粉采集量[4]。因此准确确定花粉采集时间至关重要。有研究发现，栽培牡丹的初开期花粉萌发率最高，为70%～75%；野生牡丹在绽口期采集的花粉萌发率最高，达90%；由于大多数木本植物在中午散粉量最大，因此采粉时间应根据牡丹品种特性，选取相应时期的花朵，于10：00至14：00进行采集[5]。

1.2 采集方法

牡丹属多年生木本植物，单花大且花粉量多，其花粉收集通常采用镊子把花药摘下，烘干或自然风干至花药开裂、散粉后进行收集[6]；如天气条件不适宜采集花粉情况下，为保证花粉活力，可将田间成熟花枝带回室内进行水培至散粉进行收集[7]；在运输途中需注意花粉保鲜，防止失活[8]。

不同时期牡丹花朵采集方法不同。采集牡丹蕾期的花朵，应在保鲜条件下带回实验室水培养(或营养液培养)进行自然散粉，收集后的花粉放在室内硫酸纸上摊放晾干或烘干[9]。采集绽口期的花朵，直接剥取花药，放入垫有光滑硫酸纸的培养皿中，保鲜条件下带回室内放入装有硅胶的干燥器内或烘干至花药开裂后收集花粉[10]。采集牡丹盛花期的花朵，可先用纸袋套在花朵上面，然后轻轻敲打花的茎段，花粉自然脱落于纸袋中[11]。3个时段收集花粉的方法各有优缺点，前2种方法均为室内采集，其花粉都不是在原株上成熟散粉。第1种室内培养花蕾的花粉活力相对偏低，但采集的花粉种类纯正，不会掺杂别的花粉；第2种和第3种方法需特别注意要采集处女花，以防昆虫访花后带有其他种类的花粉，可在花朵开放前对其进行套袋处理。

2 花粉活力测定方法

花粉活力的高低直接影响杂交育种的结果，因此在进行杂交育种前花粉活力测定是不可或缺的一步，目前牡丹花粉活力测定主要有染色法和离体萌发测定法。

2.1 染色法

染色法中测定花粉活力最常见的是氯化三苯基四氮唑染色法(TTC法)，氯化三苯基四氮唑即红四氮唑，是标准的绒化还原色素，水溶液无色，遇到活细胞内的脱氢酶接受氢离子，还原后变红生成不溶于水的三苯甲胯，呈红色，故此用来测定花粉活力，有生活力的花粉都会被染成红色，无活力的呈无色[12]。其优点是测定速度快，但TTC法在测定过程中出现过渡色，颜色鉴别有困难，测定结果往往偏高。其他常见染色法如醋酸洋红法和I2-KI染色法均不适合牡丹花粉染色，律春燕等[13]用醋酸洋红法(浓度1%)和I2-KI(浓度5%)分别对黄牡丹花粉染色发现，醋酸洋红将花粉全部染成红色，I2-KI将花粉基本染为黄褐色，两者均无法判定花粉有无活力。

2.2 离体萌发测定法

离体萌发测定法指将花粉进行离体培养，通过观察其花粉管生长的现象来确定花粉活力的大小[14-15]，检测效果比较准确，在显微镜下可直观地区分出活力较弱、没有活力和活力较强的花粉，应用广泛，对贮藏花粉和新鲜花粉都适用。离体萌发测定法培养花粉需要特定的培养基，常用的培养基有液态和固态2种，其中以离体萌发液体培养基法最为简便。液体培养基法是用毛笔等适宜工具蘸取适量花粉后均匀撒播于载玻片的凹槽内，凹槽内含有配制好的液体培养基，之后将其放在垫有湿滤纸的培养皿中，加盖置于恒温箱内(25±1)℃培养[16-18]。固体培养基法是在液体培养基中加入琼脂，其他成份均相同。2种方法都是在一定培养环境控制下，由离体培养时的萌发率来判定花粉活力，方法均体现出简单合理并可定量的优点，但离体萌发测定法应用中花粉的萌发条件对其活力影响较大，如培养基中的营养物质、矿质元素、培养温度与时间等都会影响花粉萌发率[19]。

3 花粉培养条件

3.1 培养基成分

3.1.1 蔗糖和硼酸 蔗糖和硼酸是花粉培养基的基本成分。蔗糖作为花粉萌发所需的主要营养物质兼顾渗透压调节剂，其浓度大小对花粉萌发至关重要，如培养基中蔗糖浓度过高，渗透压增大，会导致花粉失水而产生质壁分离和花粉破裂等现象，从而使花粉萌发率降低[19-20]。牡丹花粉培养所需的蔗糖质量浓度一般在50～200 g/L，具体的质量浓度因品种的不同而存在差异[21]，但野生和栽培牡丹花粉培养所需蔗糖质量浓度没有明显差异[22]。硼酸的作用主要是参与糖分吸收转运和代谢以及果胶质的合成等过程，从而促进花粉萌发，牡丹花粉培养所需的硼酸质量浓度一般在30～80 mg/L。野生牡丹花粉培养所需硼酸质量浓度较栽培牡丹低[22]。不同牡丹品种间花粉培养所需蔗糖和硼酸质量浓度不同，黄牡丹花粉培养适宜的质量浓度为蔗糖150 g/L、硼酸30 mg/L[13]；黑花魁牡丹花粉适宜培养基为蔗糖50 g/L、硼酸40 mg/L；夜光杯牡丹花粉较理想的培养基为蔗糖50 g/L、硼酸80 mg/L[23]。施江等[24]以12个牡丹品种为研究对象，用固体培养基培养得出较适合牡丹花粉萌发的蔗糖质量浓度为 150 g/L左右，硼酸质量浓度为60～80 mg/L。

3.1.2 其他成分 Ca2+可以诱导花粉管产生一定的趋向性，使花粉管朝Ca2+浓度高的方向生长，但外界Ca2+质量浓度过高可导致牵引型Ca2+通道受损，从而抑制花粉管生长。研究发现，Ca2+单独用于牡丹花粉萌发时其质量浓度在0～200 mg/L作用不明显，以40 mg/L浓度最佳，高于300 mg/L时抑制萌发；Ca2+浓度为20 mg/L时与蔗糖、硼酸两两组合后对花粉萌发率有极显著影响，但三者同时作用却无显著差异[13]。

钾和镁是构成细胞渗透势的重要组分，但单独用于黄牡丹花粉萌发的作用不显著，高于300 mg/L时抑制其萌发[17]。赤霉素为植物生长调节剂，对牡丹花粉萌发有显著促进作用。试验发现，适宜牡丹萌发的赤霉素质量浓度为25～50 mg/L，不同的牡丹品种适宜的赤霉素浓度存在差异[24]。聚乙二醇-6000(PEG-6000)溶于水、甲醇等，其与疏水性分子结合后的产物可用作非离子表面活性剂。试验证明，PEG-6000对花粉萌发有一定的促进作用，适宜花粉萌发的质量浓度为150～200 g/L，高于200 g/L时抑制作用明显[24]。

3.2 培养条件

3.2.1 培养时间 不同品种牡丹花粉萌发所需时间有明显差异，研究发现，野生牡丹品种花粉萌发时间短于栽培品种，野生牡丹品种花粉萌发时间一般为7～8 h[5]，而栽培品种一般为8～16 h[25-26]，栽培品种分单瓣品种和重瓣品种，单瓣品种萌发时间比重瓣品种萌发时间短且集中[27]。

3.2.2 温度 适合的温度有助于花粉萌发，过高或过低对花粉的萌发都会产生不利影响。花粉培养一般在恒温培养箱里进行，适宜的培养温度为22～28℃[10]，不同品种牡丹花粉萌发的适宜温度无明显差异[19]。

3.2.3 pH 适宜的pH能增加花粉的透水性，利于花粉孔扩张。花粉外壁耐酸碱，内壁不耐酸碱，pH过高，其碱性环境会导致花粉内壁溶解；pH过低，其酸性环境则影响内壁软化效果。有研究发现，随着pH升高，牡丹花粉萌发率有升高趋势，当pH超过7.5时，花粉萌发率下降[28]。不同品种间花粉萌发的适宜pH差异较小，在一定pH范围内杨山牡丹(Paeoniaostii)、紫斑(Paeoniarockii)和卵叶(Paeoniaqiui)牡丹的花粉萌发率随着pH升高呈上升趋势，杨山牡丹花粉在pH 6.5时达最大值，紫斑(Paeoniarockii)和卵叶牡丹花粉在pH 7.0时达最大值[26]。综合看，牡丹花粉离体萌发较为适宜的pH为6.5～7.5。

4 花粉贮藏

花粉贮藏是解决杂交育种中亲本花期不遇现象的重要举措。影响花粉贮藏寿命的因素除遗传因素外，环境因素中贮藏温度和花粉本身含水量是决定花粉活力持续时间长短的重要因子[29-31]。

4.1 温度

贮藏花粉活力的重要影响因素之一是温度。一般情况下，花粉贮藏寿命随温度降低而增加，呈负相关关系[32]，原因是温度与花粉内部的呼吸强度关系密切，低温降低呼吸强度，而高温增加呼吸强度导致花粉营养枯竭，从而降低花粉贮藏寿命[33]。研究表明，牡丹花粉在室温下(25±1)℃可以贮藏1～2周，4℃条件下可以贮藏90～180 d，在-20℃下可贮藏180～300 d，超低温保存(低于-70℃)可以贮藏1 a以上，具体贮藏时间因品种而异[34-38]。

4.2 含水量

影响贮藏花粉活力的另一个重要因子是花粉含水量。一定范围内，花粉贮藏寿命随含水量增加而减少[15,39]。花粉含水量低，降低酶活性和呼吸作用，从而延长花粉贮藏寿命,但极干燥条件也不利于花粉保存[39-44]。收获花粉后进行适当干燥可避免花粉冷冻过程中的伤害，尤其是超低温贮藏时，贮藏前要将花粉含水量降低，避免冰冻后结块。相关研究表明，牡丹花粉超低温保存最适含水量为7%～11%[37]。

4.3 超低温贮藏后的解冻方式

研究发现，经超低温贮藏后花粉活力的高低与解冻方式有关，尤其是液氮保存后花粉的化冻方式对其活力有显著影响。尚晓倩[37]研究发现，芍药花粉超低温保存后，30℃温水浴快速解冻可以保持较高的萌发率；然而盖树鹏等[34]研究认为，牡丹花粉超低温保存后用自来水冲洗解冻效果最好。

5 小结与展望

牡丹花粉活力测定应采用花粉离体萌发法，此法简单准确，可直观判定花粉的活力。染色法虽然迅速，但其染色剂除能使正常花粉着色外也能使未成熟、衰老和败育的花粉着色，最后花粉活力测定值往往偏高[45-47]。花粉贮藏时应选择合适的贮藏温度和花粉含水量，低温和相对干燥的条件对花粉的贮藏有利，但各个温度条件下花粉贮藏的最适含水量研究较少，干燥程度不确定，无法大幅度提高花粉的贮藏寿命，明确花粉干燥程度或含水量范围是下一步需要解决的问题。在其他植物花粉贮藏研究中发现，CO2气体中贮藏的花粉寿命延长，2×104Pa条件下可贮藏9 d；在O2气体中贮藏，花粉寿命缩短[48]。然而目前极少有对牡丹花粉在CO2、N2及O2等气体介质中和不同压强下的贮藏研究，这将是牡丹花粉活力贮藏研究的一个方向，同时贮藏后花粉萌发的温度选择又是花粉活力贮藏研究的一个重要内容。

在牡丹杂交育种特别是利用花期差异杂交育种中，需要清楚所选亲本的花期是否相遇，对花期不遇的亲本需清楚错期天数才能更好地选择花粉保存方式。选择花期差异较大的牡丹亲本进行杂交易获得优异新种质，也可通过牡丹的近缘种如芍药杂交创造变异，育成新品种。一般牡丹早开品种比晚开品种提前14～19 d开花，牡丹晚开品种比芍药早开品种提前7～15 d开花。花粉贮藏在牡丹育种中解决了花期不遇的问题，而牡丹花粉活力研究和牡丹花期调查对人工授粉具有重要指导意义，加大对花粉活力的研究力度，将对牡丹育种产生巨大的推进作用，进一步促进该新型油料作物的推广普及。