烟曲霉在果树生产上的安全应用探讨

汤逸飞

(浙江省嘉兴市农业综合检验检测中心,浙江 嘉兴 314050)

长期以来，化肥、农药和薄膜是果农实现增产增收的重要手段，病虫害是影响果树生产的一个重要问题。目前，过度施肥、残留高剂量农药、白色污染或是秸秆焚烧都会影响地区农产品销售的信誉和口碑。因此，防治果树病虫害、治理果树环境污染和提高农作物秸秆利用率意义重大。烟曲霉(Aspergillus fumigatus)是在世界范围内广泛存在的一类真菌，耐盐，耐高温(30～40 ℃)，遗传性状稳定。早在20世纪40年代，已经有报道列出从烟曲霉代谢中分离到的一种物质烟曲霉酸(Fumigacin)可以作为杀菌剂应用于农业生产[1]，这种杀菌剂来源天然，研究认为能阻断病原真菌蛋白质合成[2]。多年来，烟曲霉的应用一直有文献报道，已证明对果树生产环境中的有机质[3]、残留农药污染[4-6]、废弃农用薄膜污染[7]和蒽污染[8]均有很好地降解作用。利用烟曲霉高效的生物降解能力及其次生代谢产物的高生物活性，以再利用的农作物秸秆作为碳氮源制成的烟曲霉具有潜在的应用价值。

1 果树生产的安全性

1.1 活体烟曲霉的鉴定

烟曲霉是否安全，首先要对果树内的真菌进行培养分离鉴定。烟曲霉活体菌株的检测方法主要以真菌形态学和分子生物学手段进行。

不同地区的烟曲霉在真菌形态学上趋于一致：致密圆柱形的分生孢子头、顶囊的形状和分生孢子的特征，因此基于标准培养基上的菌落生长形态、颜色、显微形态以及色素形成等情况，在加上通过镜检可以基本判断适合一些像烟曲霉比较常见的菌株。平板培养观察烟曲霉菌落有辐射状皱纹，非标准培养基上基内菌丝根据底物营养不同，呈青黄色到烟土色不一。镜检下，烟曲霉产孢结构有类似的伞状结构，分生孢子梗发生于基质，菌丝有隔，分生孢子球形。孢子体积较小，在空气中易飘散，普通光学显微镜须在放大1 000倍(100×10)下能够清楚观察到孢子形态。这样的传统形态学方法观察则比较简单方便。

利用分子生物学检查也是目前最常用的手段，菌株的鉴定不会受到实验人员的经验水平影响，比较客观[9]。并且烟曲霉基因序列相对保守[10]，一般采用rDNA-ITS序列分析即可鉴定菌种。

1.2 次生代谢产物的安全性

烟曲霉活体菌株鉴定虽然解决的菌种定性的问题，但无法区分是否为带毒菌株。烟曲霉有毒的次生代谢产物多以震颤真菌毒素(Verruculogen)、烟曲霉震颤素B(Fumitremorgin B)、胶毒霉素(Gliotoxin)等为标志化合物，这些代谢产物结构独特，利用色谱、光谱和质谱技术定性分析，或利用核磁共振技术进行结构鉴定，可作为带毒菌株的定性分析，但使用和维护费用较为昂贵。

目前，真菌毒素在食品原料和(或)食品成品可食用部分中允许的最大含量水平在0.5～60 μg/kg[11]。以烟曲霉中的胶毒霉素为例，其产量约在15 mg/L[12]，控制水量稀释800～1 000倍制成对有助于保证次生代谢产物在果树生产的安全性。

1.3 生产环境的安全性

烟曲霉一直被认为对人和牲畜较为危险的致病真菌[13]，其发酵产物经常用于曲霉病发病机制的模型建立[14,15]，但从果树生产环境的角度看，作为天然存在的菌种，烟曲霉其本身是被投放在湖水中，已证明结果较为安全[16]。从果树本身角度看，烟曲霉作为植物内生菌群之一，在正常生长的农作植物中能够分离得到烟曲霉[17]。果树生产环境相对开放，并且在烟曲霉在植株生长中并未有明显的毒害作用，同时作为非靶生物的人和牲畜一般认为是在低抵抗力的情况下受到烟曲霉孢子侵犯得病[18]，使得烟曲霉在果树生产上的安全利用存在可操作性。

2 农作物秸秆再利用

2.1 烟曲霉的驯化和保存

烟曲霉对农作物秸秆生物转化能力比较强，可采用菌株驯化筛选的方法[19]，将察氏固体培养基中的碳源蔗糖(或葡萄糖)按比例逐步兑换为果树秸秆粉，将最后用纯农作物秸秆粉培养的烟曲霉作为种子培养基，培养基其他成分可采用察氏固体培养基配方，进行至少90 d的固体培养。当固体培养基至瓶内颜色开始出现青色时，将其作为原菌种封口冷冻保存。

2.2 烟曲霉的扩大培养

活化的固体培养基可以转接菌丝和基质到装有培养液，培养液成分除琼脂外与种子培养基保持一致，参考条件控制在30 ℃以上，转速120 rpm以上，培养至少30 d以上，以获得母液。培养初期液体培养基呈白色或淡黄色，菌体形状不规则但明显，随着培养时间增加，色素慢慢累积呈青绿色，培养基液体颜色也呈现黄色。通过母液多批次接种获得成规模烟曲霉培养液，每批次培养至少30 d以上，待菌团或菌丝变大变多后，采用3层纱布过滤获得。

2.3 烟曲霉的性状特点

将烟曲霉用水稀释800～1 000倍，制得烟曲霉，现配现用。该制剂呈淡黄色，包含烟曲霉孢子、菌丝体和秸秆颗粒等不溶物。烟曲霉中代谢产物主要活性成分为小分子生物碱[20]和有机酸[21]，因此可通过紫外-可见光分光光度计测定总生物碱[22]和有机酸[23]的含量。

3 潜在应用价值

3.1 增加土壤肥力

烟曲霉可以以农作物秸秆粉为底物，烟曲霉发酵得到代谢产物。烟曲霉的原料底物秸秆中含有碳、氮、磷、钾等元素，通常情况下纤维素、半纤维素和木质素难以短时间降解，并且若直接在田间腐熟，未完全腐熟情况下容易产生大量病菌和虫卵；烟曲霉能产生多种酶，如纤维素酶、木聚糖酶、淀粉糖化酶和β-1，6-葡聚糖酶等，对稻草[24]、玉米[25]、棉[26]等果树秸秆均能作为碳源利用和降解。

3.2 减少果树病虫侵害

烟曲霉中存在对稻瘟病、纹枯病或赤星病病原真菌有抑菌效果的生物碱和有机酸，包括烟曲霉酸、12β-羟基-13α-甲氧基黄霉素TR-2、震颤真菌毒素和烟曲霉震颤素B等，这些次生代谢产物在实验室条件下的抗病效果均与广谱杀菌剂多菌灵(Carbendazim)或恶霉灵(Hymexazol)相当[27]。另外，烟曲霉中存在烟曲霉诱导的胞外几丁质酶，也可能产生意想不到的效果[28]。目前，商品化的几丁质杀虫剂Clandosan在美国已经应用于园艺植物。该产品宣传可以促进土壤微生物产生一种杀死线虫和虫卵的几丁质酶，以致杀灭根瘤线虫(Meloidogyne spp.)[29]。而烟曲霉本身能够分泌几丁质酶，因此，施用烟曲霉在土壤中可能有直接防治害虫或者与其他微生物协同防治的潜力。

3.3 降低果树环境污染

烟曲霉中存在低剂量烟曲霉孢子和菌丝可能起到烟曲霉的生物降解作用。在实验室条件下已经证明烟曲霉对甲胺磷[4]、阿特拉津[5]、西玛津[5,6]等农药有降解能力，并且能够降解小分子聚乙烯薄膜残体，在“光照+烟曲霉”综合降解模式下可缩短农用薄膜的降解周期[7]。

4 展望

烟曲霉有毒次生代谢产物多为环境因素影响。比如在高浓度氯化钠胁迫条件下，烟曲霉代谢大量产生胶毒霉素(Gliotoxin)[12]。一方面，通过去毒提取工艺和产毒机理研究，可以提高利用烟曲霉的安全性。如何让烟曲霉本身减毒或是通过层析等分离方法将其去毒，这需要尝试。比如采用两步发酵制有机肥法，第1步采用烟曲霉处理底物，第2步采用其他菌株处理烟曲霉代谢产物，这是一种很好的减毒探索方法[30]。再比如可以通过基因敲除、紫外诱变或抗性筛选寻找弱毒菌株，也是未来发挥高浓度烟曲霉高酶活和次生代谢产物的研究途径。另一方面，稀释倍数有利于避免微生物危险[31]，保证对环境相对亲和，为田间试用提供实际操作的可能。烟曲霉基于生化特点，以往烟曲霉基本处于配角中，比如有机肥中添加适量烟曲霉发酵被认为是有助于制备新的生物有机肥[32]；空气中带有烟曲霉孢子的混合菌种出现在我国某些传统发酵工艺中如某些酿酒、豆豉、腐乳中[33]。烟曲霉与人类的关系密切，需要理性看待其危害，其本身的经济价值尚待我们开发。