不同试剂处理对中药植物显微组织特征的影响*

秦晋钰，宋月荷，蔡翠芳

(山西药科职业学院，山西 太原 030031)

显微鉴别法作为一种中药质量评价的手段[1-3]，以操作简单、耗时短、成本低、直观准确等优点而备受欢迎[4]。显微鉴别法样品中以粉末和横切面两种形态最常用[5-10]，其中横切面更能全面直观的反映药材的细胞形状、组织构造及内含物等特征，这些特征在一定程度上与柴胡的好坏优劣有联系，而粉末显微差异并不明显[11]。邢普[12]等运用显微鉴别法清晰的展示了柴胡根、茎、叶、果实的组织横切面显微特征结构，为柴胡正本清源提供了鉴别依据。显微制片有多种方法[13]，其中以操作简单的徒手切片法最为常用[14-15]，这两种方式均需要用一定的试剂进行浸泡前处理，使其软化。实际生产中多采用水浸法处理[16-18]，这种方法在实际操作中存在着膨胀快、结构易损坏等缺点，影响观察。因此，本文欲探究一种相对优化的试剂进行浸泡前处理，使得锥叶柴胡和耳叶黑柴胡组织特征结构能够保持原状，提高切片成功率，以利于显微观察。

1 材料与仪器

1.1 材 料

试验用锥叶柴胡和耳叶黑柴胡为伞形科植物柴胡的野生品，产地为山西；水合氯醛、间苯三酚、浓盐酸、甘油、乙醇，以上试剂均来自于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪 器

试验使用Panthera显微镜，购自麦克奥迪实业集团有限公司。

2 方 法

参照《中国药典》(2015年版)规定的显微鉴定方法[19]，将锥叶柴胡的根分别用水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、水合氯醛、水合氯醛:稀甘油为1:1、水合氯醛:稀甘油为2:1、水合氯醛:稀甘油为3:1、水合氯醛:稀甘油为4:1、水合氯醛:稀甘油为5:1等10种不同的试剂进行相同时间的浸泡处理，将耳叶黑柴胡的根分别用水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和水合氯醛:稀甘油为3:1等5种试剂进行同样条件的浸泡处理，将耳叶黑柴胡的叶分别用水和水合氯醛:稀甘油为3:1的2种试剂进行同样条件的浸泡处理，进而制作徒手切片，置于显微镜下观察研究不同试剂处理时其横切面的组织特征。

3 结 果

3.1 对锥叶柴胡根显微特征的影响

柴胡根由周皮和维管束组成，位于外方的是周皮，内方呈环状排列的是无限外韧型维管束。周皮由木栓层、木栓形成层和栓内层3部分组成；维管束由韧皮部和木质部组成，见图1、图2。

图1 锥叶柴胡根显微特征图(10×4)

图2 耳叶黑柴胡根显微特征图(10×4)

3.1.1 用水和不同浓度乙醇进行浸泡处理

实验发现，用水浸泡处理后，可观察到锥叶柴胡根中木质部木射线细胞形态发生变化，细胞被拉长，细胞间界限不分明；韧皮部油管分泌细胞变形，见图3，分析是由于细胞吸水膨胀，进而体积发生变化导致的。

图3 用水浸泡的锥叶柴胡显微特征图(10×40)

用不同浓度的30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇分别浸泡处理后，可观察到锥叶柴胡根中木质部木射线细胞存在不同程度的破裂，内含物外溢，见图4；形成层界限不清晰，见图5；韧皮部细胞破裂，油管界限不分明，油管细胞破裂，见图6，分析以上现象是由于乙醇为水溶性的有机溶剂，浸泡过程中使得细胞吸收溶液而膨胀变形，甚至发生破裂。

图4 用不同浓度乙醇浸泡的锥叶柴胡木质部显微特征图(10×40)

图5 用不同浓度乙醇浸泡的锥叶柴胡形成层显微特征图(10×40)

图6 用不同浓度乙醇浸泡的锥叶柴胡韧皮部显微特征图(10×40)

3.1.2 用水合氯醛和稀甘油以不同配比进行浸泡处理

用水合氯醛浸泡处理后，可观察到锥叶柴胡根中木质部射线细胞破裂，形成管道；韧皮部细胞有破裂迹象，见图7。

图7 用水合氯醛浸泡的锥叶柴胡显微特征图(10×40)

用水合氯醛：稀甘油配比分别为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1的溶液浸泡处理后，可观察到水合氯醛：稀甘油配比分别为1:1和2:1时，锥叶柴胡根木质部和韧皮部细胞基本保持完好，偶有破裂，细胞界限仍不分明(图8、图9)。当水合氯醛:稀甘油配比为3:1时，可观察到锥叶柴胡根中木质部木射线细胞完整，界限清晰分明；形成层界限清晰；韧皮部细胞完整，界限清晰，油管清晰，见图10。随着水合氯醛:稀甘油配比增加到4:1和5:1时，可观察到锥叶柴胡根中木质部、形成层、韧皮部的细胞基本完整，界限清晰，油管清晰(图11)。

图8 用水合氯醛:稀甘油为1:1浸泡的锥叶柴胡显微特征图(10×40)

图11 用水合氯醛:稀甘油为5:1浸泡的锥叶柴胡显微特征图(10×40)

3.2 对耳叶黑柴胡根显微特征的影响

3.2.1 用水和不同浓度乙醇进行浸泡处理

用水浸泡处理后，可观察到耳叶黑柴胡根中木质部和韧皮部细胞均存在膨胀变形，部分细胞发生破裂的现象(图12)。

图12 用水浸泡的耳叶黑柴胡显微特征图(10×40)

用不同浓度的30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇分别浸泡处理后，可观察到耳叶黑柴胡根中木质部细胞存在大面积破裂，细胞界限模糊(图13)；韧皮部细胞界限不分明，油管细胞破裂(图14)。

图13 用不同浓度乙醇浸泡的耳叶黑柴胡木质部显微特征图

图14 用不同浓度乙醇浸泡的耳叶黑柴胡韧皮部显微特征图(10×40)

3.2.2 用水合氯醛和稀甘油配比为3:1进行浸泡处理

用在锥叶柴胡中优选出的水合氯醛：稀甘油配比为3:1的溶液对耳叶黑柴胡进行浸泡处理，可观察到耳叶黑柴胡根中木质部木射线细胞基本保持完好，细胞界限清晰；形成层界限分明；韧皮部细胞完整，界限清晰，油管清晰，见图15。

图15 用水合氯醛:稀甘油为3:1浸泡的耳叶黑柴胡显微特征图(10×40)

3.3 对耳叶黑柴胡叶显微特征的影响

叶的横切面一般由表皮、叶肉、叶脉3部分组成，见图16。

图16 耳叶黑柴胡叶显微特征图(10×10)

分别用传统水浸法和上述优选出的水合氯醛:稀甘油为3:1的溶液对耳叶黑柴胡叶进行浸泡处理。实验发现，相较于水浸泡处理，用水合氯醛:稀甘油为3:1浸泡处理的耳叶黑柴胡叶，栅栏组织和海绵组织细胞排列更紧密且完好，细胞间隙更清晰，见图17、图18。

图17 用水合氯醛:稀甘油为3:1浸泡的耳叶黑柴胡叶显微特征图(10×40)

图18 用水浸泡的耳叶黑柴胡叶显微特征图(10×40)

4 结 论

本文中，将水、乙醇、水合氯醛及水合氯醛与稀甘油的混合液分别作为显微制片前处理中的浸泡试剂，研究发现：

(1)不同浓度的乙醇溶液其显微组织形态比水破坏的更严重，这可能与同等条件下乙醇具有更强的挥发性有关；

(2)随着水合氯醛与稀甘油配比的增加，当比例为3:1、4:1及5:1时，显微组织特征保持完整，分析认为是由于在显微制片中常用作透化剂的水合氯醛[20]，具有能迅速渗入组织细胞，使细胞膨胀，同时溶解脂肪、蛋白质、淀粉粒等细胞后含物等特性，便于显微镜下观察组织细胞形态，和稀甘油组成混合液会使得浸泡处理和徒手切片间隙不易干裂；

(3)同一试剂浸泡后不同部位显微组织形态破坏情况不一，分析认为是由于木质部、韧皮部等不同部位的细胞吸收膨胀速度不一致。

综上所述，考虑到同等条件下以节省原料为原则，以及水合氯醛对人体的伤害和其在低温下质地黏稠不利于浸泡处理等情况，优选水合氯醛：稀甘油比例为3:1的溶液作为浸泡处理试剂，该试剂对锥叶柴胡的根及耳叶黑柴胡的根和叶均适用。值得探究的是浸泡时间长短对显微组织特征的影响，浸泡时间短，切片硬，容易碎；浸泡时间长，切片软，操作难度大，片型很难均匀；试验所用的柴胡品种及产地有限，此浸泡处理试剂对不同种类柴胡的普适性有待考证。