补阳还五汤对脑缺血后大鼠脑神经功能的影响

陈云欢 吴旋 江一静

缺血性脑卒中是一种高发病率、高致死率的疾病，脑缺血动物模型用于缺血性脑卒中治疗的疗效评价已有20 年的历史。脑缺血后神经元受损包括很多病理生理因素，如兴奋性氨基酸毒性、氧化应激、炎症反应和细胞凋亡等。补阳还五汤由黄芪、赤芍、川芎、当归、地龙、桃仁、红花七药组成，是治疗气虚血瘀型脑卒中的经方、名方，具有补气、活血、通络之效，补阳还五汤在临床上治疗脑缺血疗效显著[1]，然而其作用机制尚不明确。采用大鼠制备局灶性脑缺血模型是目前研究缺血性脑损伤发生机制及干预效果的重要手段[2]。自噬参与了生命体很多重要的过程，它一方面可以维持细胞内环境的稳态，而另一方面亦可加速细胞死亡。在脑缺血性损伤后，自噬对神经元兼具着神经保护和促进死亡的双重作用。脑血管内皮细胞自噬作为一种重要的神经系统调控靶点，在补阳还五汤治疗脑缺血中起着重要的调节作用。LAMP2 是一种溶酶体相关膜蛋白，作为CMA 的标志性蛋白，它的表达水平直接决定了CMA 的活性。本实验采用改良线栓法制备大鼠脑缺血-再灌注模型[3]，用补阳还五汤进行灌胃治疗，观察自噬-溶酶体信号通路的LAMP2 的表达情况，从细胞自噬角度探讨补阳还五汤改善脑缺血的作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

成年Wistar 大鼠50 只，雄性，100 ～150 g，购自福建中医药大学动物实验中心。50 只大鼠随机分成四组：（1）正常对照组：10 只，假手术后，常规饲养于笼内，不进行任何干预治疗。（2）模型组：10 只，造模后常规饲养于笼内，不进行任何干预治疗。（3）补阳还五汤低剂量组：10 只，2.5 g/（kg·只）（按体表面积计算相关于成人剂量的0.5 倍），1 次/d，造模前灌胃7 d，造模后继续灌胃7 d。（4）补阳还五汤中剂量组：10 只，5 g/（kg·只）（按体表面积算相当于成人等效剂量），1 次/d，造模前灌胃7 d，造模后继续灌胃7 d。（5）补阳还五汤高剂量组：10只，25 g/（kg·只）（按体表面积算相当于成人等效剂量的5 倍），1 次/d，造模前灌胃7 d，造模后继续灌胃7 d。

1.2 研究方法

1.2.1 补阳还五汤制备 各单味药购自北京康仁堂药业有限公司，严格遵照原方配比而成，由福建中医药大学附属康复医院药剂科完成，置于4 ℃下冷藏备用。

1.2.2 动物模型制备 术前禁食12 h，用3.4%水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰卧位固定于手术台上，采用改良线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型，术后2 h 对大鼠进行神经行为学评价。以Longa 5 级4 分法评价模型的神经功能缺失症状。神经功能评分后断头取出鼠脑。

1.2.3 实时荧光定量PCR 扩增 大鼠脑组织RNA 提取采用trizol 法，试剂购于thermo 赛默飞公司。

1.2.4 LAMP2 的引物设计 选择Rat 的GAPDH 为内参基因，依据实时荧光定量PCR（SYBR 法）引物设计原则，根据NCBI 登录的GAPDH 基因mRNA 序列和大鼠的LAMP2 基因mRNA 序列，用Primer Premier 5.0 设计目标基因和内参基因的特异性引物，用Oligo 6.0 检验其特异性。引物（上海生工公司）序列为：

按下列组分配制PCR 反应液，配制反应液时先配制总的反应液，再各个分装。配制过程均在冰上进行。每个反应重复三次，设计实验组和阴性对照。PCR 反应的程序设置：94℃ 30sec；94℃5sec；60℃34sec，共40 个循环。各组样本采用△Ct 进行基因相对表达差异检验，P＜0.05 差异具有统计学意义；目的基因的相对表达量计算方法为2-△△Ct[4]。详见表1。

1.3 观察指标

mRNA 相对定量：各组样本采用△Ct 进行基因相对表达差异检验，各基因的mRNA 实际表达量与△Ct 值呈反比，即mRNA表达量越多，表明△Ct 值越小。P＜0.05 差异具有统计学意义，目的基因的相对表达量计算方法为2-△△Ct[4]。

1.4 数据收集处理与分析

数据用用SPSS 19.0 软件分析，多组间数据差异比较采用单因素方差分析和多个样本均数间的多重比较，采用（±s）表示，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 补阳还五汤对大鼠神经功能的影响

术后2 h模型组、低剂量组、中剂量、高剂量组与假手术组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）。模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组各组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。术后第7 天，补阳还五汤灌胃治疗后大鼠神经功能得到一定程度的恢复。模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组与假手术组比较差异具有统计学意义（P＜0.01）。模型组与低剂量组比较差异无统计学意义（P＞0.05），与中剂量组和高剂量组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。低剂量组与中剂量组比较差异无统计学意义（P＞0.05），与高剂量组比较差异具有统计学意义（P＜0.01）。中剂量组与高剂量组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.2 实时荧光定量PCR 结果

各组之间mRNA 扩增表达两两间比较差异具有统计学意义（P＜0.01），见表3。以模型组为对照组，按2-△△Ct规则计算各组的LAMP2 mRNA 相对表达量，如图1 示，正常组、低剂量组、中剂量组、高剂量组mRNA 相对表达水平较模型组均上调（均P＜0.01）。正常组表达量最高，高剂量组高于中剂量组，中剂量组高于低剂量组。以正常组为对照组，按2-△△Ct规则计算各组的LAMP2 mRNA 相对表达量，如图2 示，高剂量组大于中剂量组，中剂量组大于低剂量组，低剂量组大于模型组（均P＜0.01）。

3 讨论

脑缺血导致神经功能损伤的机制复杂，与多种机制有关。缺血再灌注后，大鼠脑部缺血缺氧诱发兴奋性氨基酸（EAA）毒性作用、一氧化氮（NO）细胞毒效应、调控凋亡相关基因表达等因素[5-6]可致神经功能受损。此外，细胞自噬在其中也扮演了重要角色，自噬是细胞程序性调控的重要生命活动之一。在哺乳动物低氧缺血、局灶性脑缺血或全脑缺血的模型中，都可诱发神经元自噬[7-8]。细胞在缺氧情况下可激活自噬，通过降解损伤蛋白提供能量，并合成新的蛋白，对神经细胞起保护作用。研究认为细胞自噬能够缩小缺血再灌注后病变大脑体积，缓解脑水肿，减少神经元死亡，改善神经功能和行为损伤，起到减轻神经细胞受损的作用。然而，自噬的过度活化可能会导致细胞自体消化并诱发神经元死亡，加重脑损伤程度[9-11]。

自噬-溶酶体途径能为重要细胞功能提供营养物质，还能清除多余或损伤的细胞器、错误折叠蛋白及入侵的微生物，有利于神经功能恢复及内环境的稳定[12]。哺乳动物的自噬-溶酶体途径有三种形式：大自噬（macroautophagy）、小自噬（microautophagy）以及分子伴侣介导的自噬（chaperone- mediatedautophagy，CMA）[13]。其中CMA 途径能在热休克蛋白（HSC70）等分子伴侣的介导下特异性地识别异常的蛋白质，将其运送到溶酶体膜上，溶酶体膜表达跨膜蛋白LAMP-1 和LAMP-2，两者在功能上可相互代偿。LAMP-2 是一种糖基化1 型膜蛋白，作为主要的溶酶体膜蛋白，直接参与了中性粒细胞的黏附、抗原提呈和分子伴侣性自噬。LAMP2 作为CMA 的标志性蛋白，其在溶酶体膜上的表达水平直接决定了CMA 的活性[14-15]。

表1 各试剂名称和使用量

表2 补阳还五汤对大鼠神经功能评分的影响（±s）

表2 补阳还五汤对大鼠神经功能评分的影响（±s）

注：1）与假手术组比较P ＜0．01；2）与中剂量比较，P ＜0．05，其中模型组与中剂量组比较，Z=-2．046，P=0．041；3）与高剂量比较，P ＜0．01，其中模型组与高剂量组比较，Z=-3．421，P=0．001；低剂量组与与高剂量组比较，Z=-3．31，P=0．001

组别 术后2 h 术后7 d假手术组 0 0模型组 2．17±0．51） 2．11±0．541）2）3）低剂量组 2．28±0．561） 1．94±0．461）3）中剂量组 2．17±0．431） 1．5±0．401）高剂量组 2．22±0．511） 1．11±0．301）

表3 各组LAMP2 mRNA 扩增的△Ct（±s）

表3 各组LAMP2 mRNA 扩增的△Ct（±s）

组别 例数 △Ct正常 8 0．665±0．084模型 8 2．684±0．128低剂量 8 2．091±0．115中剂量 8 1．655±0．098高剂量 8 1．110±0．053

图1 LAMP2 mRNA 的相对表达水平

图2 LAMP2 mRNA 相对表达量

补阳还五汤是我国治疗缺血性脑卒中的传统名方，临床疗效确切。本研究中，采用改良线栓法制备大鼠脑缺血-再灌注模型，以Longa 5 级4 分法评价模型的神经功能缺失症状。造模后2 小时，模型组，补阳还五汤低剂量组、中剂量组、高剂量组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。造模7 天后，模型组与低剂量组，低剂量组和中剂量组，中剂量组和高剂量组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组与中剂量组、高剂量组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）：低剂量组与高剂量组比较差异具有统计学意义（P＜0.01）。研究结果表现出一定的剂量依赖性，显示补阳还五汤高剂量对大鼠脑缺血明确有效，低剂量明确无效，中剂量疗效不明确，可能受样本例数与老鼠对药物反应与体内代谢各异有关。模型的实时荧光定量PCR 结果显示补阳还五汤对LAMP2 mRNA 表达量影响显著，呈现出剂量依赖趋势。模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组较正常对照组LAMP2RNA 表达量均降低（P＜0.01）：低剂量组、中剂量组、高剂量组较模型组LAMP2RNA 表达量均升高；补阳还五汤低剂量组、中剂量组、高剂量组之间俩俩比较差异具有统计学意义（P＜0.01），随着剂量的增高表达量也增加。

实验结果表明，补阳还五汤能通过上调LAMP2 表达影响CMA 的活性，进而启动自噬调控使脑缺血大鼠运动感觉功能恢复和减轻脑损伤。但有关补阳还五汤如何调控，经过什么信号传导通路，有哪些细胞因子参与尚需要进一步研究。