大蒜素对冠心病大鼠心脏的保护作用及对主动脉形态、心肌细胞CaSR蛋白和凋亡指数的影响

许文克，史永恩，孟祥斌，张卫杰，高传玉

炎症和氧化应激反应亡引起的动脉粥样硬化（AS）是导致冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病，CHD）发生和发展的重要原因，冠状动脉（冠脉）狭窄以及主动脉损伤均是冠心病的重要特征[1,2]。由氧化应激反应以及炎性反应诱导的心肌细胞凋亡是影响心功能促进冠心病进展的关键。钙敏感受体（CaSR）是G蛋白偶联受体超家族的成员，最新研究显示心肌灌注不足会引起CaSR的升高和心肌细胞凋亡[3]。大蒜素是从大蒜中提取的一种生物活性化合物，具有抗炎、 抗氧化和调脂作用，临床研究显示大蒜素可抑制同型半胱氨酸的水平并调节脂代谢，治疗AS并降低冠心病发生风险[4]。本文分析大蒜素对冠心病大鼠心脏的保护作用及对主动脉形态、心肌细胞CaSR蛋白和凋亡指数的影响。

1 主要材料与方法

1.1 主要实验材料SD大鼠（SPF级，雄性，220～250 g，上海斯莱克实验动物中心，中国）。大蒜素（国家药品生物制品检定所，北京，中国）。SMT100V小动物自动生化分析仪（南京电子医疗器械厂，中国）。ELISA和TUNEL染色试剂盒（碧云天公司，中国）。显微镜（Olympus公司，日本）。酶标仪（Model 680，Bio-Rad，美国）。组织匀浆机（Thermo Fisher Scientific公司，美国）。TRIzo（lSigma公司，美国）。PrimeScript-RT和SYBRPremixExTaq试剂盒（Takara公司，日本）。RIPA裂解缓冲液（中国，北京，Beyotime）。BCA试剂盒（武汉博斯特生物技术有限公司，中国）。抗体购自美国Abcam公司。PVDF膜（Bio-Rad公司，美国）。DMEM培养基和抗体、血清（Invitrogen公司，美国）。

1.2 分组、建模和干预36只SD大鼠分为对照组、CHD组和CHD+大蒜素组（n=12）。对照组大鼠正常饲料喂养。CHD组和CHD+大蒜素组大鼠根据参考文献[5]，使用自制高脂饲料构建CHD模型，高脂饲料在正常饲料中加入蛋黄粉（10%）、胆固醇（2%）、猪油（10%）、丙基硫氧嘧啶（0.2%）、胆酸钠（0.5%）。通过尾静脉收集血样，用 SMT100V小动物自动生化分析仪检测三酰甘油（TG）、胆固醇（TC）及低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平验证建模结果。CHD+大蒜素组大鼠使用大蒜素灌胃，剂量为20 mg/kg·d[6]，其余两组大鼠注射等量生理盐水作为对照，连续14 d。

1.3 检测指标和方法

1.3.1 ELISA应用ELISA检测检测心肌酶指标和内皮功能指标。大鼠麻醉后处死， 采集心脏内血液样本，离心2000 rpm，20 min后取上清液。按说明书分别加入抗体和显色剂，通过酶标仪检测450 nm处吸光度，根据标准曲线计算乳酸脱氢酶（LD）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、内皮素-1（ET-1）和一氧化氮（NO）浓度。

1.3.2 HE染色检测心肌细胞损伤和主动脉形态大鼠腹腔注射戊巴比妥后断头处死，取出心脏和主动脉组织，4%的聚甲醛固定并用梯度醇脱水，包埋于石蜡中，制成厚度4 μm切片制作玻片标本。加入苏木精在室温下赋孵育 10 min，加入0.5%曙红溶液室温下孵育3 min，显微镜下观察。

1.3.3 氧化应激指标将心肌组织制作成组织匀浆，3000 rpm离心25 min，根据氧化应激试剂盒（三工生物技术有限公司，中国）检测丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）水平。

1.3.4 TUNEL染色检测凋亡按上述方法制作心肌组织玻片标本，根据TUNEL试剂盒及逆行染色，按说明书加入试剂染色，在显微镜下观察。在高倍镜下随机观察5个视野计数凋亡细胞数百分比为凋亡指数。

1.3.5 qPCR检测Mrna使用Trizol获得心肌组织中总RNA，逆转录cDNA试剂盒逆转录1 μg RNA用于合成cDNA（42℃ 60 min，70℃ 5 min，4℃保存）。使用SYBRGreenPCRMasterMix和PCR检测系统进行qPCR实验（95℃/10 min，40个循环，94℃/15 s，60℃/1 min，60℃/1 min，4℃保存）。使用 GAPDH作内参，通过比较循环阈值分析mRNA 的水平表达。

1.3.6 Westernblot检测蛋白将心肌组织用匀浆机均匀研磨萃取总蛋白，通过BCA试剂盒测量浓度，分别取总量40 μg的总蛋白使用10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳（PAGE）（80～120 V，90 min）。在100 mV恒定电压下与PVDF膜进行湿转移。在5%牛血清白蛋白（BSA）中于室温孵育1 h。将1:500稀释的anti-CaSR、anti-PI3K和 anti-AKT添加到分离蛋白质中，4℃孵育过夜。洗涤后室温下添加二抗孵育1 h，加化学发光试剂显影。GAPDH用作内部参考，用ImageJ软件分析目标条带的灰度值。

1.4 统计学处理统计分析使用SPSS 19.0软件，数据以平均值±标准偏差（SD）表示，多组间比较进行单因素方差分析，两两比较使用SNK-q检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大蒜素对CHD模型大鼠血脂指标的影响3组大鼠的血脂指标比较，CHD组大鼠的TC（3.37±0.41）mmol/L、TG（1.44±0.16） mmol/L、LDL（1.99±0.29） mmol/L均显著高于对照组（P＜0.05），CHD+大蒜素组大鼠的TC（2.79±0.36）mmol/L、TG（1.05±0.13）mmol/L、LDL（1.32±0.25）mmol/L水平显著高于对照组而低于 CHD组（P＜0.05），表1。

表1 大蒜素对CHD 模型大鼠血脂指标的影响

2.2 大蒜素对CHD大鼠心脏的保护作用通过检测心肌酶指标分析的大蒜素对CHD大鼠心脏的保护作用。CHD组大鼠的LD（2201.56±289.04）IU/L和CK-MB（1286.92±136.69）IU/L均显著高于对照组（P＜0.05），CHD+大蒜素组的LD（1828.59±264.36）IU/L和CK-MB（905.28±131.43）IU/L水平显著高于对照组而低于CHD组（P＜0.05），表2。

表2 大蒜素对CHD 大鼠模型心肌酶指标的影响

2.3 大蒜素对CHD大鼠模型内皮功能的影响CHD组大鼠的ET-1（1.80±0.21）pg/ml高于对照组而NO（32.69±6.70）μmol/L低于对照组（P＜0.05）。CHD+大蒜素组的ET-1（1.54±0.178）pg/ml显著低于CHD组，NO（39.57±8.34）μmol/L显著高于CHD组（P＜0.05）。

2.4 大蒜素对CHD大鼠心肌组织损伤的影响对照组的心肌细胞成纤维状有序排列，细胞质和细胞核染色均匀，细胞核饱满；CHD组大鼠心肌细胞染色不均匀，排列紊乱；CHD+大蒜素组的心肌组织损伤情况较CHD组有所缓解，心肌细胞染色不均匀但排列有序，图1。

图1 HE染色检测大蒜素对CHD 大鼠心肌组织损伤的影响（×100）

2.5 大蒜素对CHD大鼠氧化应激指标的影响CHD组大鼠的MDA（9.78±1.12）nmol/ml高于对照组，而SOD（116.04±11.67）U/ml低于对照组（P＜0.05）。CHD+大蒜素组的MDA（5.62±0.95）nmol/ml显著低于CHD组，而（147.58±12.18）显著高于CHD 组（P＜0.05），表3。

表3 大蒜素对CHD 大鼠氧化应激指标的影响

2.6 大蒜素对CHD大鼠心主动脉形态的影响对照组主动脉HE染色结果显示动脉壁结构清晰，内膜平滑，细胞结构正常且排解紧密。CHD组的主动脉血管壁明显增厚，细胞膨大、排列紊乱。CHD+大蒜素组血管结构基本清晰，细胞形态和排列基本正常，动脉壁增厚情况有所改善，图2。

图2 HE染色检测大蒜素对CHD大鼠心脏主动脉形态的影响（×200）

2.6 大蒜素对CHD大鼠心肌细胞凋亡的影响如图3所示，深棕色染色为凋亡细胞的细胞核。三组凋亡指数比较差异显著（P＜0.05）。CHD组凋亡指数（2.35±0.45）%显著高于对照组（11.65±1.21）%，CHD+大蒜素组的凋亡指数（5.93±0.82）%显著高于对照组而低于CHD组（P＜0.05）。

2.7 大蒜素对CHD大鼠心肌细胞CaSR水平影响CHD组大鼠的CaSRmRNA和蛋白水平均显著高于对照组（P＜0.05），CHD+大蒜素组的CaSRmRNA和蛋白水平显著高于对照组而低于CHD 组（P＜0.05），见表4，图4。

图3 TUNEL染色检测大蒜素对CHD大鼠心肌细胞凋亡的影响（×400）

表4 大蒜素对CHD大鼠心肌细胞中CaSR mRNA 和蛋白水平的而影响

图4 Wester blot检测大蒜素对CHD大鼠心肌细胞CaSR水平

3 讨论

大蒜中的主要活性成分为大蒜素（2-丙烯-1-磺基硫磺酸 S-2-丙烯基酯）[7]，研究发现其可通过改变高脂饮食动物的脂肪酸组成保护心血管[8,9]。本研究结果显示大蒜素可明显抑制血脂指标并减少心肌酶LD和CK-MB水平，保护心功能。由AS引起的CHD会使主动脉内皮细胞造成损伤并进一步影响心功能[10]。结果还显示大蒜素可明显缓解CHD大鼠的主动脉损伤，并调节NO和ET-1水平。有研究显示大蒜素可能有助于减轻高胆固醇血症兔的主动脉病变[11]。此外，大蒜素通过调节氧化应激和炎性反应保护心脏肥大组织微血管内皮细胞功能[12]，提示在CHD大鼠模型中，大蒜素可能通过调控氧化应激通路保护心肌组织，保护主动脉血管。活性氧的累积引起的心肌细胞凋亡参与CHD 进展[13]。CaSR参与调控钙和金属离子的系统体内稳态，在心肌缺血再灌注中，CaSR促进磷酸化的PKCδ易位至线粒体引起钙超载，引起心肌细胞凋亡[14,15]。本研究显示CHD组的心肌细胞凋亡率及心肌组织中CaSR mRNA和蛋白的水平高于对照组，而CHD+大蒜素组大鼠心肌细胞凋亡率及心肌组织中CaSR mRNA和蛋白的水平显著低于CHD组。大蒜素作为抗氧化剂，有效减轻急性多柔比星中毒引起的心脏氧化损伤和凋亡[16]。大蒜素也可能通过调节失衡的NOX/Nrf2 通路改善线粒体功能并抑制活性氧的产生[17]。而抑制CaSR可显著缓解心肌细胞凋亡，从而保护心力衰竭大鼠心功能[18]，提示大蒜素可能通过抑制 CaSR 的表达和抑制氧化应激反应抑制心肌细胞凋亡。

综上所述，大蒜素可能通过抑制 CaSR的表达及氧化应激反应保护血管内皮功能，保护心肌组织损伤，对CHD大鼠模型起到缓解作用。但关于大蒜素调控 CaSR和氧化应激的分子机制及大蒜素与CaSR的关系仍需进一步研究。