高强度间歇训练对冠心病患者心肺功能、生活质量及miRNA表达谱的影响

孙漾丽，顾迎春，李征艳，孙兵兵，马娟，侯亚敏，张友峰，赵智琛，胡大一， 王东伟

近年来，随着我国人口老龄化的加剧和人们生活方式的改变，冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）发病率呈逐年升高趋势，已成为重要的健康威胁。临床实践证实，运动康复是治疗冠心病的有效方式，能显著降低复发，延缓病情进展，减少心脏不良事件发生率，是极为重要的二级预防策略[1]。目前已经有多种运动康复的锻炼方案，其中高强度间歇训练（HIIT）是一种在短时间内进行全力、快速、集中锻炼的锻炼方式。目前国外已有研究证实连续8周的HIIT训练是对冠心病患者安全并且有效的，其效果优于传统的规律性有氧运动[2]，但在国内外对此运动方案带来的冠心病的病理生理作用分子调控机制鲜有报道。

microRNA（miRNA）是指真核细胞中负责基因转录后调控蛋白表达的一类非编码短链RNA，其在心血管系统存在广泛表达并发挥了重要的生理调节功能，尤其在冠心病的病理进程中发挥了调控作用[3]。尽管有研究初步证实，规律运动能显著调控血清miRNA表达谱[4]，但目前miRNA与HIIT相关的研究仍较少。因此，本研究将探索HIIT运动方案对冠心病患者的康复疗效及miRNA参与冠心病二级预防中运动获益的相关机制。

1 对象与方法

1.1 研究对象选取2018年1月～12月于郑州大学附属郑州中心医院心脏康复科就诊的冠心病患者80例，随机分为高强度间歇训练组（HIIT）和常规治疗组（Control），所有患者签署伦理知情同意书。两组患者基线数据均无统计学差异（P＞0.05，表1）。

表1 两组研究对象基本资料比较（n，%）

纳入标准：年龄18～75岁；符合运动实验标准、训练标准（Exercise Standards for Testing and Training，2013年美国版）和冠心病的诊断标准；对运动康复依从性高，能完成8周训练者。

排除标准：急性心肌梗死4周内；心律失常合并血流动力学异常；哮喘、COPD、肺栓塞以及脑卒中等无法进行高强度运动；关节炎、风湿、风湿病或其他骨科疾病无法正常运动训练；听力或语言障碍等影响医患交流的情况；其他认为无法进行运动训练的情况。

1.2 治疗方案Control组和HIIT组患者均接受冠心病常规抗血小板药物及降脂药物治疗，根据治疗指南建议，药物治疗以阿司匹林肠溶片及氯吡格雷双联口服，其中阿司匹林肠溶片100 mg/d，氯吡格雷75 mg/d。加强教育指导保证患者的药物依从性。

HIIT组：除了常规药物治疗外，患者接受运动方案如下：75%～80% HRmax训练4 min+50%HRmax恢复3 min，训练4组共28 min，训练前热身5 min，训练后放松5 min。4 次/每周，共8周。训练均在监护下进行，严密监护患者的心率、血压及主观劳累程度，如有不适立刻停止运动。训练前做心肺运动试验和心脏彩超评估患者心功能、运动能力及劳累程度分级，训练8周后再次行运动心肺试验检查。

1.3 观察指标

1.3.1 心功能分别记录两组患者干预前及干预后的6 min步行距离（6MWD）、左心室射血分数（LVEF）、左心室舒张末期内径（LVEDD）。

1.3.2 生活质量采用36条简明健康状况调查表（SF-36）评估各组患者在入组时及疗程结束随访时的生活质量，具体问卷及评分标准详见参考文献[5]。

1.3.3 肺功能及运动耐量评估采用科时迈心肺运动评估仪检测各组患者的肺功能及运动耐量评估指标，包括心率、氧脉搏（O2/HR）、分钟通气量、公斤摄氧量（VO2/Kg）、无氧阈（AT）等。

1.3.4 患者血清样本收集和microRNA基因芯片分析所有研究对象于入组时采集肘静脉血5 ml于EDTA管中，低温4℃ 20 000 r/min离心10 min分离血浆，转移上清液重复离心去除杂质。在两组患者中随机选取三个样品进行microRNA基因芯片（AffymetrixGeneChip miRNA 4.0，美国Affymetrix公司）高通量分析，使用芯片公司配套的分析软件进行数据统计和分层聚类分析。

1.3.5 Real-time PCR验证和定量测定采用AmbionmirVana miRNA Isolation试剂盒（Thermo Fisher公司，美国）分离提取血清总miRNA，然后使用逆转录试剂盒对提取的总miRNA进行逆转录，得到miRNA对应的cDNA链。然后进行全样本miRNA荧光定量检测，以U6为内参基因，以2－△△Ct计算目标miRNA的相对表达量。C1000 Touch梯度PCR仪的反应参数为：94℃ 2 min；94℃ 20 s，60℃ 34 s，40个循环。实验操作按照试剂盒操作说明进行。引物序列如下：

miR-20a-5p: forward: 5′- CTTATGCCATCTT GGCGG -3′;

miR-20a-5p reverse: 5′- CGCGTACCGGAGT CAGG-3′

miR-93-5p: forward: 5′-GTCCAGGTGAGAG TGTCGT-3′;

miR-93-5p reverse: 5′-GGTCATGTGCTAC GTTT-3′.

miR-1287-5p: forward: 5′- CTGAGGGCA GGGACATCGT-3′,

miR-1287-5p: reverse: 5′-GGTCTTCATCGC GAGGGCGG-3′

miR-7706: forward: 5′- TTCGAGAAGTGCAG CGAC-3′,

miR-7706: reverse: 5′-AGTACTCGCCGATTG TGGC-3′

miR-28-5p: forward: 5′-CATCCGGAGAGAC GGACAT-3′

miR-28-5p: reverse: 5′-TTGTACAGCTGCAG TGGAC-3′

miR-125b-5p: forward: 5′-GGGCAGAGGGC GGATT-3′

miR-125b-5p: reverse: 5′-AGGATCAGT GCTAC-3′

U6: forward: 5′-GTCGGTACAGATCTGTGGC AC-3′

U6: reverse: 5′-GATTATCGGCCCCGCGACAT TC-3′

1.4 统计学处理所有数据均采用SPSS 22.0统计学软件分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间差异比较采用t检验，组内治疗前后比较采用配对t检验。计数资料采用例数（构成比）表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者干预前后心功能比较在治疗开始前，Control组和HIIT组患者的心功能指标无显著差异（P＞0.05）；经过8周干预治疗后，Control组和HIIT组患者6MWD、LVEF、LVEDD较治疗前均得到显著改善（P＜0.05）；而HIIT组患者的心功能改善显著优于Control组患者（P＜0.05）（表2），提示HIIT将有助改善冠心病患者心功能，促进患者康复。

表2 两组患者干预前后心功能比较

2.2 两组患者干预前后肺功能比较在治疗开始前，Control组和HIIT组患者的肺功能指标无显著差异（P＞0.05）；经过8周干预治疗后，HIIT组患者AT时氧脉搏、AT时分钟通气量、最高氧脉搏和最高每分钟通气量指标显著优于其治疗前（P＜0.05）和治疗后的Control组患者（P＜0.05）（表3），提示HIIT将有助改善冠心病患者肺功能和运动耐量。

2.3 两组患者干预前后生活质量比较在治疗开始前，Control组和HIIT组患者的生活质量指标无显著差异（P＞0.05）；经过8周干预治疗后，Control组和HIIT组患者生理功能、生理职能、躯体疼痛和总体健康较治疗前均得到显著改善（P＜0.05）；而HIIT组患者的生活质量改善显著优于Control组患者（P＜0.05）（表4），提示HIIT将有助改善冠心病患者生活质量。

表3 两组患者干预前后肺功能比较

2.4 两组患者的miRNA基因芯片筛选结果采用AffymetrixGeneChip miRNA芯片检测Control组和HIIT组患者在干预治疗结束后miRNA表达谱差异，该芯片覆盖成熟体miRNA的30424个探针组以及人miRNA前体2025个。差异基因的筛选标准为q-value≤5%。通过miRNA芯片的筛选，88个基因差异表达；其中表达上调或下调差异化程度最高的20个miRNA如miRNA 芯片聚类分析图所示（图1）。

表4 两组患者干预前后生活质量比较

图1 miRNA芯片聚类分析图

2.5 Realtime PCR验证根据miRNA芯片筛选结果，对其中表达差异化程度最高的6个miRNA进行全样本Realtime PCR验证，结果如图2所示，与Control组患者相比，HIIT组患者血清中的miR-20a-5p，miR-93-5p和miR-1287-5p表达显著增加，而miR-7706，miR-28-5p和miR-125b-5p表达显著降低。其中miR-20a-5p表达最高，而miR-125b-5p表达最低，提示miR-20a-5p和miR-125b-5p可能参与HIIT改善冠心病的进程（图2）。

图2 miRNA的Realtime PCR验证结果。#表示P＜0.05和##表示P＜0.01与Control组患者相比

3 讨论

在社会老龄化、生活习惯和环境污染等因素的共同影响下，我国人群的冠心病患病率显著增加，冠心病本质是一种缺血性心血管疾病，往往会引起冠脉硬化、心梗和心衰等严重不良事件[6]。临床实践早已证实，运动康复是治疗冠心病的重要辅助手段，结合药物管理、风险因素控制以及良好的生活方式等，能够显著降低心血管事件和猝死的发生，运动康复已经成为冠心病治疗研究的重要内容[7,8]。

高强度间歇训练（HIIT）是一种高强度与间歇性相结合的运动方式，显著促进氧气消耗和身体代谢。国内研究证实，与传统有氧运动方式相比，高强度间歇训练更能增强人群有氧能力和运动耐量，改善心肺功能。既往杨京辉等研究发现，高强度间歇运动可有效改善糖尿病前期患者空腹血糖和餐后2 h血糖水平且减脂效果较传统中等强度持续运动更佳[9]。研究显示，高强度有氧间歇运动可增强老年人群的心脏射血功能，提高心排出量和每搏输出量，并减低静息状态下的心肌耗氧量，同时可改善血管弹性状况，对血压、血糖、血脂产生积极的影响[10]。国外研究早于2004年发表的研究显示，高强度有氧间歇运动优于中等强度运动，可提高冠脉疾病患者的运动耐力，改善心肺功能[11,12]；并且多项研究的安全性评估结果显示，在专业康复医生的指导下，高强度有氧间歇运动不会增加冠心病患者心血管不良事件的发生率[13-15]。但目前国内关于高强度有氧间歇运动对冠心病患者的作用效果如何尚未有研究报道。本研究中冠心病患者经过高强度有氧间歇运动康复治疗后，患者的心功能指标、肺功能指标以及生活质量均得到显著改善，提示高强度有氧间歇运动康复可以改善运动耐量，增强心肺功能，改善患者的预后。

目前关于运动康复治疗在心血管疾病中的病理生理调控机制尚不清楚。研究认为，多种miRNA是运动增强心脏功能的重要调控靶点分子[16-18]，研究证实，运动训练恢复心肌梗死后心肌细胞中miRNA-1和-214的表达水平，从而调节Ca2+浓度，改善心肌功能[19]。而Radom等更进一步证实，运动训练可使动脉粥样硬化性血管病患者的血清循环miRNA恢复到非病理水平，对于患者的心血管功能康复具有重要意义[20]。本研究经过miRNA芯片检测，筛选获得了一批在两组患者中差异表达的miRNA，并对其中差异化程度的miRNA进行了Realtime PCR验证，证实其中miR-20a-5p，miR-93-5p和miR-1287-5p表达显著增加，而miR-7706，miR-28-5p和miR-125b-5p表达显著降低，由此可见，miRNA在运动康复治疗的过程中起到了重要的调控作用。但是，因为本研究样本量少，可能存在病例的选择性偏倚而导致结论不准确，并且对于筛选鉴定得到的miRNA在运动康复中的生理功能仍需要进一步的研究探索。相信随着更深入研究的开展，miRNA在冠心病的运动康复治疗中的作用机制会更加明确[21]。

综上所述，本研究证实，高强度间歇训练能有效改善冠心病患者心肺功能，增加运动耐量，提高患者生活质量，其作用可能是通过调控miRNA表达来实现。这为今后冠心病的运动康复治疗研究提供了新的生物学依据。