豆渣发酵工艺优化研究及其腐乳产品开发

王霏霏，王 莎，李丹林

（浙江农林大学 暨阳学院，浙江 诸暨 311800）

0 引言

我国作为生产加工大豆的主要国家之一，在生产各种豆制品的过程中均会产生大量的副产品——豆渣。研究表明，这些豆渣占全豆质量的16%～25%。豆渣含有丰富的营养价值，含蛋白质18%～23%，膳食纤维50%～55%，还含有人体必需的8 种氨基酸及丰富的矿物质和维生素[1]。但是，豆渣水分含量高，容易腐烂发臭变质，并且传统豆渣口感粗糙难以消化，使得人们对豆渣产品接受度差，因此豆渣的潜在价值远远没有充分开发利用。

目前，豆渣改性方法主要有机械粉碎法、酸-碱水解法、生物发酵法等，其中发酵法产率高、操作简便、成本低廉，并且微生物发酵能有效提高豆渣中的营养成分。罗勇泉等人[2]利用酿酒酵母对豆渣和苹果渣的混合物进行固态发酵，结果发现混合苹果渣的豆渣经发酵后口感得到明显改善。谢欢等人[3]利用黑曲霉发酵豆渣，结果发现黑曲霉发酵豆渣有效提高了豆渣膳食纤维的品质。鉴于此，选用黑曲霉、小曲、黑曲霉- 小曲混菌种发酵豆渣，以氨基酸态氮为指标，探究最佳发酵菌种并采用正交试验探究该菌种的最佳发酵工艺；同时，研究了豆渣发酵前后纤维素酶活、半纤维素酶活及其粒径分布，旨在探究有一种高氨基酸态氮含量、口感良好、膳食纤维品质高的发酵豆渣，并以此豆渣为主要原料，研制一种高营养价值的腐乳，更大程度地利用豆渣，变废为宝，同时也为腐乳行业提供了新的发展方向。

1 材料与方法

1.1 主要材料

黄豆，安徽燕之坊食品有限公司提供；新鲜豆渣由实验室自行研磨而得。

试验菌种：黑曲霉、毛霉菌种，锦润生物提供；小曲，安琪酵母股份有限公司提供。

1.2 仪器设备

GZX-9076MBE 型电热鼓风干燥箱、SW-CJ-1CU 型超净工作台，上海博迅实业有限公司产品；KQ-500B 型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品；DY04-13-44-00 型压力蒸汽灭菌器，上海东亚压力容器制造有限公司产品；BSD 型振荡培养箱，上海精宏实验设备有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 豆渣腐乳工艺流程

新鲜豆渣→121 ℃高温蒸汽灭菌→冷却接种→发酵培养→接种毛霉→腌坯、调味装罐→腐乳成品。

1.3.2 单因素发酵条件优化试验

准确称取30 g 豆渣在一定条件下分别接种一定量的黑曲霉、小曲、黑曲霉- 小曲混菌种（黑曲霉与小曲的比例为1∶1），取接种量、发酵温度、发酵时间3 个因素进行单因素试验，发酵结束后测定样品中氨基酸态氮的含量，确定发酵效果最好的菌种并探究该菌种最佳发酵条件，测试3 次，取平均值。

1.3.3 正交试验

根据单因素试验的结果进行L9（34）正交试验，确定最佳工艺。

正交试验因素与水平设计见表1。

表1 正交试验因素与水平设计

1.3.4 腐乳产品开发

将发酵后的豆渣团切成5 cm×5 cm 的方块，在其表面均匀喷洒毛霉悬浮液，平放于铺有3 层无菌纱布的笼屉之中，控制环境温度为20 ℃左右，同时还需要保持一定环境湿度。约5 d 后腐乳坯表面会布满酶丝，加食盐腌制，逐层加食盐并随层数增高而增加食盐量，接近瓶口的食盐要铺厚一点，8 d 左右加食盐腌制完成，对于腐乳的调味按照糟方调味方式，装罐封存，即为腐乳成品。

1.4 测定方法

1.4.1 氨基酸态氮的测定

氨基酸态氮的测定采用GB 5009.235—2016《食品中氨基酸态氮的测定》中第一法：酸计度法。

1.4.2 酶活的测定[4-5]

（1） 半纤维素酶活的测定。取1 g 发酵后的豆渣用蒸馏水稀释并且定容至100 m 容量瓶中，取0.5 mL溶液并在其中加入1.5 mL 多糖，酶解30 min，然后用DNS 法测定木糖含量。酶活计算公式如下：

式中：m——所测木糖质量，μg；

M——豆渣样品质量，mg；

30——酶解时间，min；

0.5 ——测试样品体积，mL；

100——样品总体积，mL。

（2） 纤维素酶活的测定。纤维素酶活测定同上，仅将需要测定的木糖替换为葡萄糖。

1.4.3 粒度分布

采用湿式筛分法测定豆渣粒度分布。

取10 g 发酵后的豆渣样品，置于250 mL 的三角瓶中，加入200 mL 的水，随后将其置于超声波清洗器中超声处理，促使豆渣颗粒分布均匀（超声条件：水温20 ℃，50 W，40 kHz，20 min）。超声处理后的豆渣样品放置于恒温振荡培养箱中振荡处理（振荡条件：水温60 ℃，转速80 r/min，时间4 h）。将处理后的已经给颗粒分散均匀的豆渣倒入依次叠好的标准筛中进行筛析（标准套筛由上至下叠放顺序：筛孔直径为1 500，900，450，200，30 μm 标准检验筛），每层标准筛用清水冲洗5 min，将残留在筛上的豆渣颗粒分别依次转入事先编号的称量皿中，于烘箱中105 ℃烘干至恒质量，称取质量并分别计算质量分数（%），由此依次求出0～30，＞30～200，＞200～450，＞450～900，＞900～1 500，＞1 500 μm 颗粒质量分数（%）。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 接种量对氨基酸态氮含量的影响

取30 g 豆渣置于250 mL 的锥形瓶中，分别按0，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%的接种量加入黑曲霉、小曲、黑曲霉- 小曲混菌种，在35 ℃下发酵2 d，发酵结束后测定豆渣中氨基酸态氮的含量。

接种量对各菌种发酵豆渣产生氨基酸态氮含量影响曲线见图1。

由图1 可知，发酵后豆渣中的氨基酸态氮含量水平显著升高，并且呈现先升高后下降的趋势。当接种量为1%时，小曲和黑曲霉结合小曲发酵豆渣产生的氨基酸态氮含量出现最高值，分别为0.35，0.39 g/100 g；当接种量为1.5%，黑曲霉发酵豆渣产生氨基酸态氮含量最高，达到0.33 g/100 g。这说明当菌种接种量较少时，产酶量不足，即分泌的蛋白酶不足，分解蛋白质效率较低，进而影响氨基酸态氮的产率。同时，当接种量过大时菌体过度繁殖，菌内竞争激烈，菌体所获得的营养成分不够充足，生长代谢受到限制，甚至还会造成菌体早衰，不利于发酵，因此高浓度的接种量使得氨基酸态氮产率逐渐开始下降。

2.1.2 发酵温度对氨基酸态氮含量的影响

发酵温度对氨基酸态氮含量影响曲线见图2。

由图2 可知，发酵温度上升使得发酵后豆渣氨基酸态氮含量呈现先上升再下降的趋势。当发酵温度为30 ℃时，黑曲霉发酵豆渣得到的氨基酸态氮产量最高，达到0.33 g/100 g；当发酵温度为35 ℃时，小曲、黑曲霉结合小曲发酵得到的氨基酸态氮产量最高，分别为0.36，0.37 g/100 g。这主要是由于温度的增加影响了黑曲霉及小曲中的酵母、根霉的生长和代谢，同时也受到蛋白酶最适温度的影响。

2.1.3 发酵时间对氨基酸态氮含量的影响

发酵时间对氨基酸态氮含量影响曲线见图3。

由图3 可知，随着发酵时间的增加，氨基酸态氮含量增加，且随着发酵时间的增长氨基酸态氮产量增长速率逐渐变慢，豆渣水分增加，同时从3 d 开始黑曲霉发酵豆渣产生了不愉快的气味且气味逐渐变重，这都不利于后期腐乳产品的成型与滋味。因此，取3 d 为小曲、黑曲霉、黑曲霉结合小曲发酵豆渣最佳时间，所得氨基酸态氮分别为0.37，0.36，0.42 g/100 g。

2.1.4 单因素试验结论

由上述研究可得，黑曲霉结合小曲发酵豆渣产生的氨基酸态氮含量明显高于单菌发酵，发酵效果更好，因此选取黑曲霉- 小曲混菌种进行后续正交试验，根据上述研究，接种量选取0.5%，1.0%，1.5%；温度选取30，35，40 ℃；发酵时间选取1，2，3 d 进行正交试验。

2.2 正交试验结果分析

正交数据试验与结果见表2。

表2 正交数据试验与结果

由表2 可知，A，B，C 3 个因素的主次顺序为A＞B＞C，即对黑曲霉结合小曲发酵豆渣中氨基酸态氮含量影响最大的是接种量，其次是发酵温度，影响最小的是发酵时间。最佳发酵条件为A2B2C3，即接种量1%，发酵温度35 ℃，发酵时间为3 d。在此条件下，豆渣中氨基酸态氮含量达到0.42 g/100 g，较未发酵豆渣的0.13 g/100 g，提高了3.23 倍。

2.3 纤维素及半纤维素酶活的变化

豆渣经黑曲霉- 小曲混菌种在最佳发酵条件下发酵所产生的纤维素酶活和半纤维素酶活与未发酵豆渣所含酶活对比。

纤维素与半纤维素酶活变化见图4。

由图4 可知，发酵后豆渣的纤维素酶活与半纤维素酶活均有显著上升的趋势，发酵后纤维素酶活达到3 169.48 μg·min·mg，是未发酵豆渣的2.02 倍，半纤维素酶活达到5 447.37 μg·min·mg，是未发酵豆渣的10.64 倍。纤维素酶活与半纤维素酶活的变化影响豆渣中膳食纤维的结构与含量，纤维素酶和半纤维素酶降解水不溶性膳食纤维多糖，使水溶性膳食纤维多糖成分得到增加，使得豆渣中SDF/TDF 增高，提高膳食纤维品质，从而提高以发酵豆渣为原料的豆渣腐乳的营养价值。

2.4 粒径分布

豆渣经黑曲霉- 小曲混菌种在最佳发酵条件下发酵后的粒度分布与未发酵豆渣粒度分布对比。

豆渣发酵前后粒径分布见图5。

由图5 可知，未发酵豆渣粒径主要集中在＞200 ～450 μm 和＞450～900 μm，共占74.74%，其中0～30 μm 的颗粒仅占5.86%。而发酵后的豆渣粒径则主要分布在＞30～200 μm 和＞200～450 μm，共占74.19%，0～30 μm 的颗粒为未发酵豆渣的2.66 倍，并且发酵后豆渣几乎不含＞900 μm 粒径的颗粒。即经过发酵，豆渣大颗粒被降解成小颗粒，豆渣粒径明显变小，有利于腐乳产品渣感降低，更利于吞咽与消化。

2.5 腐乳产品的开发

经毛霉接种的豆渣坯见图6，进行腌坯的豆渣腐乳见图7。

发酵后的豆渣坯经毛霉接种，2 d 菌丝开始进行生长，3 d 菌丝生长旺盛，5 d 豆渣坯表面布满菌丝。由图6、图7 可知，毛霉在豆渣坯上生长良好，并且进过毛霉接种、腌坯的豆渣腐乳坯同时也具有良好的成型性，因此利用发酵后的豆渣制做腐乳是可行的。

3 结论

通过单因素试验和正交试验，以氨基酸态氮为评价指标，得到了黑曲霉- 小曲混菌种对豆渣大分子蛋白分解最佳发酵条件为接种量1%，发酵温度35 ℃，发酵时间3 d，在此发酵条件下，氨基酸态氮值可达到0.42 g/100 g，是未发酵豆渣的3.23 倍，提高了豆渣的营养价值和风味。

同时，黑曲霉- 小曲混菌种发酵豆渣后，豆渣中的纤维素酶活和半纤维素酶活增加显著，分别为未发酵豆渣的2.02 倍和10.64 倍，提高了豆渣膳食纤维品质。发酵后豆渣的粒径逐渐变小、渣感显著降低、吞咽较为容易，且发酵后豆渣毛霉生长良好。因此，利用发酵后豆渣制得一种营养价值高的腐乳是可行的。