菠萝皮渣中醋酸菌的分离与筛选

宋 曦，汪 慧，王应强，张亚亚

（陇东学院农林科技学院，甘肃庆阳 745000）

0 引言

果醋是以水果为原料，经酒精、醋酸发酵后形成的一种发酵饮品[1]。果醋有增进食欲、促进消化、降低血胆固醇、预防动脉粥样硬化和心脑血管疾病等功效，兼具果蔬的营养功能，富含多种维生素、矿物质，使果醋成为了备受青睐的功能型饮品[2-3]。

在果醋发酵过程中，醋酸菌的性能对产品品质有较大的影响，而具有优良发酵性能的耐醇、耐酸菌株选育也成为果醋生产中新的研究热点[4-6]。野生醋酸菌来源广泛，自然界中土壤、水果、空气中均可分离获得。符桢华[7]研究了用菠萝弃渣自然发酵醋酸菌。尚云青[8]以菠萝皮渣为原料，分别添加AS1.41和沪酿1.01 醋酸菌制作果醋，沪酿1.01 产醋酸性能较好。国内从菠萝皮渣中分离醋酸菌并应用到果醋发酵中的研究较少，多使用商品用菌株，主要原因为野生菌株发酵性能较差。菠萝在消费过程中产生大量弃渣，经自然放置一段时间后可富集周围环境中的醋酸菌，从中分离筛选醋酸菌，以期获得能够应用于果醋发酵工业的性能优良的菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料

菠萝皮渣（市售，产地：海南）.

1.1.2 主要试剂

葡萄糖、酵母膏、甘油、乙醇95%、CaCO3、酚酞指示剂（0.5%）、（NH4）2SO4、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4、乙酸钙、乳酸钙、浓硫酸、琼脂、斐林试剂、溴酚蓝水溶液（0.04%）、FeCl3、草酸铵、结晶紫染液、碘液、番红染液、碘化钾、0.1 mol/L NaOH溶液。

1.1.3 仪器和设备

JJ-200 型电子天平、YXQ-LS-40S11 型立式蒸汽压力灭菌器、SPA-150B 型生化培养箱、XSP-2CA型生物显微镜、 BCD-206STPH 型海尔冰箱、JB-HS-1300U 型洁净工作台、离心机、恒温振荡培养箱、分光光度计等。

1.1.4 培养基[9]

（1） 基础发酵培养基。酵母膏1%，葡萄糖1%，pH 值4.5，于121 ℃下灭菌20 min 后备用，使用前添加4%Vol 无水乙醇。

（2） 碳酸钙平板分离培养基。基础发酵培养基中加入琼脂2%，CaCO32%，于121 ℃下灭菌20 min，待温度冷却至55 ℃后加入无水乙醇3%Vol，摇匀倾倒于无菌培养皿中。

（3） 醋酸菌斜面保藏培养基。酵母膏1%，葡萄糖1%，琼脂2%，KH2PO40.05%，MgSO40.05%，分装于试管中，于121 ℃下灭菌20 min，温度冷却至55 ℃后加入无水乙醇3%Vol，摆成斜面即可。

（4） 生理生化鉴定培养基。Horyer-Frateur 培养基、GYC（葡萄糖- 酵母膏- 碳酸钙） 培养基生酮培养基、产5- 酮基葡萄糖酸盐试验培养基、产葡萄糖酸试验培养基、乙酸氧化试验培养基、乳酸氧化试验培养基、氧化乙醇试验培养基、葡萄糖发酵培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 醋酸菌分离筛选流程

原材料→增殖培养→菌种分离→革兰氏染色→产醋酸定性试验→菌株初筛→菌种复筛→生理生化试验。

1.2.2 增殖培养

菠萝皮渣在室温下放置1 周自然发酵，称取10 g自然发酵液，置入盛有100 mL 基础培养基的三角瓶中，于32 ℃下以转速150 r/min 振荡培养72 h。

1.2.3 样品稀释培养

取1 mL 增殖培养液置于99 mL 无菌生理盐水的三角瓶中，然后吸取1 mL 稀释液到9 mL 无菌生理盐水的试管中，依次梯度稀释，获得最终含量为1×10-4，1×10-5，1×10-6，1×10-7，1×10-8的稀释液。用移液枪准确吸取各梯度稀释液1 mL 于无菌培养皿中，并倾注CaCO3平板分离培养基，于32 ℃恒温培养箱中培养72 h，挑选菌落形态一致、有透明圈的单菌落。

1.2.4 菌种纯化

挑取以上培养的目的单菌落，在CaCO3平板分离培养基上多次划线分离纯化，并接种于斜面保藏培养基上。

1.2.5 菌株的初筛[10]

对分离菌株所产透明圈直径进行比较。然后从分离培养基上挑取菌落形态一致、H/C 值（透明圈直径与菌落直径的比值） 较大的单菌落，进行下一步研究。

1.2.6 革兰氏染色

将初筛得到的菌株进行革兰氏染色并镜检。

1.2.7 产醋酸定性试验

参考杜连祥[11]的方法。

1.2.8 菌种复筛

将初筛得到的菌种接种于产酸发酵培养基中，每株菌做3 个平行，在32 ℃下以转速150 r/min 恒温振荡培养72 h，产酸量高的菌株为复筛得到的菌株。

1.2.9 生理生化试验[12-14]

接触酶的试验、GYC 培养基产色素试验、单一氮源生长试验、产5- 酮基葡萄糖酸盐试验、产葡萄糖酸试验、产纤维素试验、氧化乙酸能力试验、氧化乳酸的试验、氧化乙醇试验、甘油生酮试验、发酵葡萄糖试验。

1.2.10 产醋酸量的测定

参考姜晓芝等人[15]的方法。

1.2.11 产醋酸量随时间变化曲线

将醋酸菌接种于50 mL 发酵培养基中，于32 ℃下以转速150 r/min 恒温振荡培养，分别在发酵12，24，36，48，60，72，84，96，108，120 h 测定各菌的产醋酸量，做3 个平行，绘制各菌株的产醋酸量随时间变化曲线。

1.2.12 醋酸菌生长量的测定

将醋酸菌接种于50 mL 发酵培养基中，于32 ℃下以转速150 r/min 的恒温振荡培养，培养12 h 后，分别在13，14，15，16，17，18，19，20，21，22 h测定菌种的生长情况，做3 个平行，绘制生长曲线。

2 结果与分析

2.1 菌种初筛

从菠萝残渣中分离醋酸菌，选取在CaCO3分离平板培养基上有透明圈的菌株作为研究对象，共得到4 株菌，分别标记为B1，B2，B3，B4，对以上4 株菌分别进行革兰氏染色，B1为革兰氏阳性杆菌；B2，B3，B4为革兰氏阴性杆菌；将3 株革兰氏阴性杆菌分离纯化，保藏于斜面试管。

2.2 产醋酸定性试验结果

对接种B2，B3，B4菌种的发酵液进行产酸定性试验，在发酵液中加入5%FeCl3溶液后，3 个菌种发酵液中均有红褐色沉淀产生。

产醋酸定性试验结果见图1。

由图1 可知，初筛得到的3 株微生物经恒温振荡培养后均能产生一定量的醋酸，醋酸与FeCl3结合，形成红褐色沉淀。结合革兰氏染色试验结果，确定初筛分离到的细菌为产醋酸细菌，具体菌属可根据生理生化鉴定结果判定。

2.3 菌种复筛

将初筛得到的3 株菌分别进行发酵试验，在发酵72 h 后测定发酵液中醋酸含量，结果为B2菌种在发酵72 h 时产醋酸量仅为0.37 g/100 mL，B3产醋酸酸量为0.9 g/100 mL，B4产醋酸量为0.83 g/100 mL。说明B2发酵产醋酸能力较弱，B3，B4产醋酸能力较强，可达到B2产醋酸量的2 倍以上。根据初筛得到微生物产醋酸能力，B3，B4相对产醋酸量高，将其作为进一步研究对象。

2.4 生理生化试验结果

对B3，B4分别进行生理生化试验。

B3，B4部分生理生化鉴定结果见表1。

生理生化鉴定结果表明，复筛得到的2 株产醋酸细菌性能基本相同，仅GYG 培养产色素试验结果有差别，B3试验结果为阳性，B4试验结果为阴性；在甘油生酮试验中，2 株细菌均产生沉淀，但B3试验产生的沉淀较多，B4试验产生的沉淀较少；其他生理生化试验结果基本相同。

表1 B3，B4 部分生理生化鉴定结果

B3，B42 株菌在革兰氏染色后观察到其细胞形状均为杆状，无球杆状，革兰氏阴性，且在培养基上不产生水溶性色素，菌苔光滑，发酵葡萄糖试验为阴性，在pH 值为4.5 的液体培养基中可以生长，并可氧化乙酸产生CO2，通过菌种形态和生理生化试验结果，察看《常见细菌鉴定手册》可确定分离得到的产酸细菌为醋酸杆菌属，该结论与前期产醋酸定性试验结果相符，对其发酵过程中产醋酸量进行测定，以确定其在有氧发酵条件下产醋酸的最佳发酵时间。

2.5 产醋酸量试验结果

将B3和B4在相同条件下恒温振荡培养，对培养过程中产醋酸量进行测定。

B3，B4产醋酸量随时间变化图见图2。

随着培养时间的增加，分离菌株产醋酸量先升高后降低，B3，B4菌株产醋酸量在32 ℃培养84 h 达到最高，产醋酸量分别为1.12 g/100 mL 和1.2 g/100 mL；84 h 后2 株菌的产醋酸量均大幅降低，B3产酸量降低38.4%，B4产醋酸量降低41.7%；菌株之间产醋酸量差异较小，在84 h 时B4产醋酸量比B3仅高0.08 g/100 mL。于32 ℃下以转速150 r/min 恒温振荡培养B3产醋酸量差异显著（p＜0.05），B4产醋酸量差异极显著（p＜0.01）。可见B3，B4菌株在温度32 ℃，转速150 r/min 的发酵条件下，培养84 h 达到产酸量高峰。微生物发酵过程中多种因素影响其产物产量，对于好氧菌株而言主要为发酵的温度和需氧量，种子的种龄、培养基的成分对其也有影响。研究中对复筛菌株在醋酸菌一般发酵条件下培养，之后可优化其发酵条件和发酵培养基，提高菌株产醋酸量。

2.6 菌株的生长曲线

B3，B4菌株生长曲线见图3。

根据OD 值结果绘制B3，B4菌株的生长曲线，可判定菌株B3的对数生长期为培养12～17 h，之后生长缓慢开始衰亡，在17 h 时OD600值达到0.37；菌株B4的对数生长期为培养12～20 h，之后迅速进入衰亡期，在19h 时OD600值达到0.36；菌株B3在温度32 ℃，转速150 r/min 的恒温振荡培养中生长曲线结果差异显著（p＜0.05），B4生长曲线结果差异极显著（p＜0.01）。采用培养基浊度测定微生物生长曲线方法较为简便，在测定后期结果可能出现误差，这是因为随着微生物培养时间的延长，一部分微生物在培养过程中衰亡、细胞裂解，且有起酵现象，导致培养基浓度增加，也就是从培养21 h 后生长曲线有增长现象[16]。在具体生产过程中，可采用平板计数法，能更准确地测定培养液中微生物活细胞数量。

3 结论

菠萝果肉营养价值丰富，菠萝弃渣作为菠萝产业的下脚料，合理利用既可以降低生产成本，又可以减少环境污染[17-18]。从自然腐败的菠萝中分离到醋酸菌，经初筛、产醋酸定性试验、复筛共得到2 株醋酸细菌，分别标记为B3，B4。对分离的菌株进行生理生化鉴定，确定其为醋酸杆菌属，对其发酵性能进行研究表明，B3，B4菌株产醋酸量于温度32 ℃，于转速150 r/min 下恒温振荡培养84 h 达到最高值，产醋酸量分别为1.12 g/100 mL 和1.2 g/100 mL；由生长曲线可判定菌株B3的对数生长期为培养12～17 h，菌株B4的对数生长期为培养12～20 h，之后迅速进入衰亡期。对已筛选的菌株后期可通过发酵条件优化和诱变育种提高其发酵能力，并应用到实际果醋生产中。