糖醋蒜理化微生物指标分析与工艺优化

刘春雷，侯进慧，孙 宇，仝 童，李 佳，钱昱含

（徐州工程学院 食品与生物工程学院，江苏 徐州 221018）

大蒜（Allium Sativum），也称为蒜头、胡蒜，鳞茎是其主要的食用部分。大蒜是我国主要的农产品出口品种，其种植地区主要以大蒜头和大蒜加工品作为商品获得经济效益，为我国农业经济发展带来了可观的产值[1]。在分类学上，大蒜属于葱科（Alliaceae） 葱属（Allium）[2]，是一种浅根性多年生草本植物，原产地分布在亚洲西部和欧洲南部等地。大蒜早期主要在古罗马和地中海沿岸的部分地区种植，随后引入我国[3]。国内大蒜资源的产品形式主要有新鲜大蒜、脱水大蒜、糖醋大蒜、大蒜片、大蒜粉、大蒜泥、大蒜汁等，也有部分企业将大蒜产品与食品加工生产技术结合生产出大蒜香肠、大蒜面包等即食食品[4-6]。新鲜大蒜中含有大蒜素、超氧化物歧化酶（SOD）、大蒜多糖、大蒜挥发油等成分，这些成分赋予大蒜的抗氧化、抗肿瘤和抗感染的作用[7]。大蒜具有降低血液中的血脂和抑制血小板聚集的作用，可以对心脑血管起到良好的保护调节作用。大蒜能改善人体细胞的免疫功能，可以促进新陈代谢、能量转换和血液循环，并可增强体质，提高身体素质[8]。

以新鲜大蒜为原料，通过改变大蒜前处理方式、腌制原料配比，从而确定糖醋蒜腌制工艺的优化参数，并对相关理化指标进行测定和微生物分析，以期为大蒜的加工企业提供有参考价值的工艺参数。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选用的新鲜大蒜产自江苏邳州；其他腌制辅料购于超市；葡萄糖、NaCl、蛋白胨、琼脂粉、结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA） 培养基及理化性质测定的相关化学试剂，国药集团化学试剂有限公司提供；细菌基因组提取及PCR 反应的所需试剂，宝生物工程（大连） 有限公司提供。

腌制所用大蒜要求新鲜肥大、无破损、无病虫、大小均匀；白砂糖、酱油、食醋等均为市售优级；处理用水为符合国家标准的生活饮用水。

1.2 仪器与设备

FA2004 型电子天平；台秤；温度计；苏泊尔不锈钢锅；泡菜专用玻璃瓶；Sigma3-16pk 型高速冷冻离心机，德国SIGMA 公司产品；三洋超低温冰箱，日本SANYO 电子有限公司产品；数显电热恒温水浴锅，上海欣蕊自动化设备有限公司产品；PCR 扩增仪，天津金思德生物技术有限公司产品；Gel Doc XR+凝胶成像系统，美国BIO-RAD 公司产品；723C型可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司产品；SW-CJ-IC 型标准型双人净化工作台，苏州净化设备厂产品。

1.3 糖醋蒜腌制

1.3.1 工艺流程

原料选择→剥皮去茎→清水浸泡→换水→再浸泡→食盐腌制→曝晒→配料液→腌制→成品。

1.3.2 操作要点[9-10]

选择无病虫、无破损、大小均匀、鳞茎整齐肥大的新鲜大蒜。在进行原料处理时削去大蒜茎盘根须，茎要保留1 cm 左右的假茎，以防散瓣，并去掉包在蒜头外面的大部分鳞片，根据所选用大蒜的老嫩只保留1～2 层内皮，清水洗净。清水浸泡时需漫过大蒜头，使之浸泡均匀。大蒜盐腌时按一层大蒜一层食盐的方法进行，并每天翻动1 次。配制糖醋卤汁时，先将食醋煮沸，再加入白砂糖进行搅拌溶化，待卤汁冷却到30 ℃左右时倒入坛中进行腌制。装坛不宜过满，离坛口3～6 cm 为宜[10]，装坛完毕后盖好坛口，进行腌制后熟。

1.3.3 工艺优化

通过改变清水浸泡时间，同时在保证相同浸泡时间的前提下，改变换水次数对大蒜进行脱臭效果的对比；通过正交试验设计不同料液比，腌制过程中每隔5 d 进行1 次风味分析，确定最短腌制成熟天数，最后结合感官鉴定，确定最佳腌制工艺。

1.3.4 感官评定

对糖醋蒜进行的感官评价主要分为4 个方面，即色泽、体态、气味、滋味。

糖醋蒜感官鉴定评分标准见表1。

1.4 糖醋蒜理化指标检测

表1 糖醋蒜感官鉴定评分标准

（1） 糖醋蒜的相关理化指标按照酱腌菜国家标准SB/T 10439—2007[11]中规定的理化指标和相应的GB/T 5009.54—2003[12]中规定的检测方法进行测定。糖醋蒜中的水分按照GB/T 5009.3—2006[13]中直接干燥法操作、食盐按照GB/T 5009.51—2003[14]中的方法操作、总酸按照GB/T 5009.51—2003[14]中的方法操作、总糖按照SB/T 10213-1994[15]中的方法测定。

（2） 羟基自由基的清除作用的测定。利用水杨酸作为捕获剂与Fenton 反应生成的羟基自由基结合，生成2,3 - 二羟基苯甲酸于波长510 nm 处有最大吸收进行羟基自由基的测定[16-18]。反应体系包含了糖醋蒜提取液、9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L 水杨酸溶液- 乙醇溶液、8.8 mmol/L H2O2溶液。

取15 g 左右糖醋蒜样品研磨至糊状，加入体积分数80%乙醇搅拌，超声波浸提15 min，过滤后取清液定容至100 mL 得样品提取液。在2 mL EP 管中分别加入稀释10 倍的样品提取液，样品管加入9 mmol/L FeSO4溶液，9 mmol/L 水杨酸- 乙醇溶液，8.8 mmol/L H2O2溶液各300 μL。为了消除糖醋蒜样品本身吸光度的影响，设置空白对照液。振荡摇匀后放入37 ℃水浴锅中水浴加热30 min 后取出，分别吸取混合反应液200 μL 于96 孔微孔板中，测定其在波长510 nm 处的吸光度。清除率（D） 计算公式如下：

式中：D——评价糖醋蒜的抗氧化活性；

A1——样品组反应后测得的吸光度；

A2——不加H2O2溶液用体积分数80%乙醇代替的样品溶液吸光度；

A3——用体积分数80%乙醇代替样品对照组的吸光度；

A4——空白对照参比，体积分数80%乙醇代替双氧水及样品溶液吸光度。

1.5 肠杆菌、霉菌指标测定

腌制成熟后对糖醋蒜成品进行微生物指标检定，微生物指标测定按照GB/T 5009.54—2003《酱腌菜卫生标准的分析方法》[12]执行，按照GB 4789.3—2016[18]《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》的方法进行试验，大肠杆菌数≤30 个/100 g，致病菌不得检出。

采用结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA） 培养基进行大肠菌群的计数检验，该培养基的配制及使用方法为：称取本品41.5 g，加热溶解于1 000 mL 蒸馏水中，煮沸不超过2 min。取适宜稀释度的样品液1 mL，加入到无菌平皿中心，将凉至45 ℃左右的VRBA 10～15 mL 置于平皿中。小心旋转平皿将培养基与样液混合。凝固后，再加3～4 mL VRBA 覆盖平板表层，于37 ℃下倒置培养48 h，观察结果。

采用孟加拉红培养基检测霉菌情况。取糖醋蒜发酵液，用无菌枪头接种于孟加拉红培养基上，无菌操作涂布3 个平板，于28 ℃培养箱中培养5 d，观察结果。孟加拉红培养基：蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，磷酸二氢钾1 g，硫酸镁（无水） 0.5 g，琼脂20 g，孟加拉红0.033 g，卡那霉素0.1 g，蒸馏水1 000 mL。

1.6 糖醋蒜中微生物分析

1.6.1 培养基

主要选用LB 培养基进行微生物筛选分离，LB液体培养基用于菌种培养，LB 液体培养基配制：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，加蒸馏水定容至1 000 mL，于121 ℃下灭菌20 min 备用；每1 000 mL的LB 固体培养基需要在LB 液体培养基的基础上加入20 g 的琼脂粉，灭菌备用。

1.6.2 菌株基因组DNA 提取与菌株16S rDNA 扩增

利用苯酚- 氯仿法抽提获得菌株基因组DNA[19]。根据提取的细菌基因组作为模板进行扩增16S rDNA。根据细菌16S rDNA 序列保守性设计合成引物[20]，F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，R：5'-G GTTAC CTTGTTACGACTT-3'。

根据试验需要设计50 μL 的PCR 反应体系：37.5 μL 无菌超纯水，5 μL 缓冲液，4 μL dNTP 上游引物F 和下游引物R 各1 μL，1 μL 模板DNA 和0.5 μL TaqDNA 聚合酶，通常第一步要先加37.5 μL无菌超纯水。反应步骤：94 ℃下预变性5 min→94 ℃下变性30 s→55 ℃下退火60 s→72 ℃下延伸90 s（包括30 个循环） →72 ℃下延伸5 min。PCR 成功后将样品送上海生工生物测序。利用生物信息学软件，结合NCBI 数据库中的信息，制作菌株系统演化树，分析菌株的分类地位。

2 结果与分析

2.1 清水浸泡脱臭效果分析

由试验可知，不同清水浸泡时间的脱臭效果不同，在相同浸泡时间下改变换水次数的脱臭效果也有差别。结果显示，浸泡2 d 左右，换水4 次时对大蒜的脱臭效果最明显。

不同浸泡时间和换水次数的脱臭效果对比见表2。

表2 不同浸泡时间和换水次数的脱臭效果对比

2.2 配方筛选

为了保证糖醋蒜特有风味和口感，采用正交试验法筛选腌制辅料的最佳配方，由于使用食盐水对大蒜进行湿腌处理时，腌制效果较差，大蒜呈现水浸状，严重影响糖醋蒜成品的外观和口感，因此在试验腌制过程中均选用干腌处理2 d，即直接将食盐撒在清水浸泡脱臭后的大蒜表面，腌制效果明显。每组试验大蒜用量均为10 kg。最后对腌制成品进行感官评定。

腌制料液配比正交试验见表3。

表3 腌制料液配比正交试验

由表3 可知，糖醋大蒜腌制的最佳配料组合为A3B3C2，最佳的分析组合为A3B2C2，即每10 kg 的新鲜大蒜需要使用1 kg 的食盐干腌，其料液配方为6 kg 食醋和3 kg 白砂糖。按照最佳分析组合进行试验验证，评分为92 分，成品糖醋蒜色泽呈红褐色有光泽，具有良好的风味，无异味，脆嫩爽口。

2.3 理化指标与微生物指标

理化指标检测结果见表4。

表4 理化指标检测结果

由表4 可知，部分理化指标与SB/T 10439—2007（酱腌菜） 中规定指标不符，但其适合当地人的口味，这对当地糖醋蒜检测指标的制定具有一定的参考价值；结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA） 培养基用于肠杆菌计数，试验结果显示，在用于肠杆菌计数的VRBA 培养基中没有菌落存在，说样品中不含肠杆菌。采用孟加拉红培养基检测糖醋蒜的霉菌情况，结果未培养出菌落，说明无霉菌污染。

2.4 糖醋蒜样品中微生物分离

通过分离，纯培养获得2 株形态各异的菌株，分别命名为C1，C2。

菌落图片见图1。

菌落特征为：C1 菌体为污白色，表面粗糙，不透明，边缘不光滑、不规则，大致为圆形，中央成花状；C2 菌体为乳白色，表面光滑，不透明，边缘比较整齐，略呈半球状凸起，实心菌落。由此初步断定2 株菌株均属于芽孢杆菌。

2.5 菌株16S rDNA 扩增

分别提取出C1，C2 的细菌基因组，作为模板进行PCR 扩增，扩增完成后利用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，结果显示获得单一清晰条带，大小为1 500 bp 左右，样品送到上海生工测序后获得序列。

电泳结果见图2。

2.6 菌株16S rDNA 序列与系统演化树分析

将测序获得的碱基序列放在NCBI 数据库中进行Blast 分析，获取高度相似序列。利用DNAMAN、Primer 等生物信息学软件进行分析，并利用MEGA构建系统演化树。序列分析结果显示分离出的2 株菌株均为芽孢杆菌属，C1 菌株与Bacillus subtilis strain SB2（MH603612.1） 的相似性达到97.81%，C2菌株与Bacillus megaterium strain E2-04（MN525604.1） 的同源性达到99.79%。

C1 菌株演化树见图3，C2 菌株演化树见图4。

3 结论

我国大蒜产业蓬勃发展，但大蒜加工产品仍旧缺乏系统深入开发，需要将传统加工技术进行现代化产业化改进，增加技术含量。开展大蒜深加工研究，可以提高大蒜销售的附加值，增加经济效益。

利用清水浸泡新鲜大蒜2 d，换水4 次时大蒜脱臭效果明显。采用正交试验确定糖醋蒜腌制辅料的最佳参数组合为A3B2C2，即每10 kg 的新鲜大蒜需要使用1 kg 的食盐干腌处理2 d，其料液配方为食醋6 kg，白砂糖3 kg。按照最佳组合进行试验验证，评分为92 分。腌制的糖醋蒜在腌制到35 d 左右时已经具有商品价值，表现出成品糖醋蒜的感官指标，如色泽、香气、滋味、质地等均符合相应的国家标准。所检测样品中不含大肠杆菌和致病菌，不存在使用工业级原料的现象，符合国家标准。对适合当地人口味的糖醋蒜产品，存在部分理化指标与国家标准不一致的情况，体现了糖醋蒜产品的地域特征[21]，在保证食品安全的前提下，可以制定糖醋蒜检测的地方标准。

分离的2 株菌株均为芽孢杆菌属，C1 菌株与Bacillus subtilis strain SB2（MH603612.1） 的相似性达到97.81%，C2 菌株与Bacillus megaterium strain E2-04（MN525604.1） 的同源性达到99.79%。芽孢杆菌被广泛地应用于食品工业、环境领域、化学农药的降解、微生物菌肥的生产、抗生素的合成、酶工业等领域[22-23]。在后续研究中，可以通过微生物分子生物学手段，分析菌株与发酵、风味的关系，推动传统大蒜发酵食品的产业化，使其具有更高的产业价值。