浅谈血凝和血凝抑制试验操作要点

王宁

（辽宁省建平县动物疫病预防控制中心 122400）

血凝试验 （HA） 是根据禽流感病毒的血凝素能与鸡红细胞发生凝集现象的特点而建立，而这种红细胞凝集现象可被特异性免疫血清所抑制，即红细胞凝集抑制试验 （HI）。

1 操作要点

1.1 血清处理与保存

采血样一般以静脉血为主，采集后要及时分离血清，保证血清清透无溶血。血清样品要尽早检测或置4℃冰箱保存5d，超过一周需置—20℃冷冻保存，切忌反复冻融[1]。

1.2 稀释液配制

HA-HI 试验缓冲液为 0.01mol/L，pH＝7.2 的 PBS，PBS 尽量现用现配，高压灭菌后使用，一经使用保存期不要超过3周。pH 要在高压后调节，若在高压前调到7.2，高压后会有所改变。

1.3 1%红细胞悬液制备

1%红细胞悬液要现用现配，采血鸡要求至少3 只SPF 成年公鸡。

洗涤鸡红细胞离心转速为1000～2000rpm，离心10min （检测禽流感抗体时1000rpm，检测鸡新城疫抗体时2000rpm）。

洗脱好的红细胞原液4℃保存备用，配制红细胞悬液时应吸取试管底部的红细胞进行稀释，若吸取上层红细胞可能会导致悬液浓度偏低。使用前一定要摇匀，防止红细胞下沉，保证每一孔中加入的浓度准确一致。

1.4 试剂的使用与保存

冻干的病毒抗原应按照说明书要求溶解并保存，可以无菌操作将其分装成小包装，以避免反复冻融，并有效减少细菌污染。

1.5 HA 试验

HA 试验测定抗原效价，做 3 个重复即可。室温 （20～25℃） 静置 40min 后观察结果。判定时，可将反应板倾斜[2]，观察红细胞有无泪滴状流淌。能使红细胞完全凝集的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价，此效价为1 个血凝单位 （HAU）。注意：对照孔应呈现完全不凝集，否则试验不成立。

HA 试验是对抗原效价的一个初步判定，最终要经过4HAU 抗原回滴对抗原进行最终校正。根据HA 试验结果配制4 个血凝单位 （4HAU） 的病毒抗原。例如血凝的终点滴度为1：256，则 4HAU 抗原的稀释倍数应是 1：64。

4HAU 抗原回滴同样做 3 个重复，稀释至第 4 列，第 5 列为红细胞对照。

若HA 效价判定准确，4HAU 抗原回滴时第1、2 孔发生凝集，第 3、4 孔流淌。

若HA 效价判定不准确，4HAU 抗原回滴出现以下两种情况。

（1） HA 效价判高，4HAU 抗原浓度会偏低，第 2 孔流淌，需添加抗原；

（2） HA 效价判低，4HAU 抗原浓度会偏高，第 3 孔发生凝集，需补加PBS。

1.6 HI 试验

HI 试验应同时设立阴、阳性对照，添加抗原后须室温静置30min 后再添加1%红细胞悬液。注意：滴加抗原和红细胞时要从后往前加，即从低浓度向高浓度加，滴头要悬空，不要接触到孔里的液体；加红细胞时要经常晃动混匀，防止红细胞下沉[3]。

结果判读以完全抑制4 个HAU 抗原的血清最高稀释倍数作为HI 滴度。滴度是指产生完全不凝集 （红细胞完全流淌) 的最高稀释度。

判定时需要与红细胞对照孔进行对照，与红细胞对照孔红细胞流淌速度一致，泪滴大小一致的稀释倍数最大孔为检测样品的最终效价。

2 结果判定

病毒对照孔：完全凝集

RBC 对照孔：无凝集

只有阴性对照孔血清滴度不大于2log2，阳性对照孔血清误差不超过1 个滴度的试验结果才有效。

测定孔：RBC 沉于孔底中心，呈纽扣状，将板倾斜呈泪滴状流淌。

血凝抑制试验效价：呈完全血凝抑制的最高血清稀释度。禽流感HI 价小于或等于3log2 判定试验阴性，HI 价等于4log2 为可疑，需重复实验，HI 价大于或等于5log2 为阳性。

3 反应条件

3.1 温度

试验要求室温 (20～25℃) 下操作，若环境温度难以控制，可将反应板置于室温温箱内。

3.2 时间

孵育时间要掌握好，不论HA 还是HI 试验，加入红细胞后孵育时间均为40min。但在一些病毒株中可见红细胞从病毒中解脱，若有此情况发生，可提前判定 （25～30min） 或 4℃下孵育。总之，红细胞对照完全凝集时即可进行判读。

4 小结

为了试验的准确性，移液器要选择合适的量程；加样、稀释时要注意力集中，避免漏加、复加；血清在稀释前要充分混匀；加抗原和红细胞时滴头要悬空，从后往前加，以免交叉污染；严格控制温度和时间；必须要进行4HAU 抗原回滴，以避免最终结果出现偏差。总之，只有认真对待每一步的操作，才能有效降低误差，得到较为准确的试验结果。