锡林郭勒绵羊品种遗传多样性研究进展

张彦斌 罗海涛 范鑫 王岩 郑玉山 张宏博

（内蒙古自治区食品检验检测中心 010090）

内蒙古自治区境内的草原是我国最大的草场和天然牧场，是国家重要的畜牧业生产基地。其中绵羊是非常重要的畜牧养殖业组成部分，随着社会发展与技术进步，绵羊通过杂交繁育出很多不同的品种，以满足人们对其乳、肉、皮毛等产品的不同需求，饲养和培育出苏尼特羊、乌珠穆沁羊、察哈尔羊、呼伦贝尔羊、乌冉克羊、滩羊、巴美肉羊、昭乌达肉羊、杜泊羊、小尾寒羊、无角陶塞特羊、德克塞尔羊、澳洲白绵羊、德国肉用美利奴羊、蒙古羊等优良品种[1,2]。锡林郭勒草原位于内蒙古自治区东中部，是水草丰美的牧场，是华北地区重要的生态屏障，境内有全国唯一被联合国教科文组织纳入国际生物圈监测体系的锡林郭勒国家级草原自然保护区。锡林郭勒羊肉品质誉满天下，锡林郭勒的羊生长在一碧万顷的草原牧场，以草原上的野生植物和优质牧草为食，饮用天然泉水，造就了 “乌珠穆沁羊”“苏尼特羊”“察哈尔羊”等优良品种，天然的环境造就了其肉质纯天然、无污染、肉质鲜嫩、营养成分富集的特点，具有稀特性和唯一性[3]。

随着锡林郭勒羊地理标志保护产品的成功申报，对扩大“苏尼特羊”“乌珠穆沁羊”“察哈尔羊”等品牌的知名度，提升产品附加值，提高经济效益、带动地区产业化发展、打击假冒伪劣等方面将起到积极的推动作用[4]。随着人民生活水平的提高，羊肉消费逐渐火热，使得不法商人看到内蒙古草原羊肉的商机所在，于是以假乱真、以次充好来获取暴利。由于高品质羊肉的需求也越来越多，而不同品种的羊肉市场需求与销售价格相差甚远，就需要对其品种与产地的进行区分。

因地理标志羊肉产品价格高销路好，其他品种与产地的羊肉冒充地理标志羊肉产品在市场上出现，为保护生产者、经营者与消费者的权益，确实做好地理产品，需对疑似肉类样本进行品种与产地上的双重鉴定。产地的鉴定主要使用同位素标记[5]进行检测，但品种间遗传多样性还没有公认可行的方法。

1 当前绵羊品种遗传多样性研究概况

绵羊品种分化、遗传多样性研究，一般是从常染色体、母系遗传标记线粒体基因组、父系遗传标记Y 染色体等不同层面进行。常染色体分析能直接反映生物种群或个体间基因组DNA的差异。相较于常染色体分析，线粒体基因组 (mt DNA) 是核外遗传物质，具有分子量小、进化速度快、遗传自主、无组织特异性，母系遗传为主，现有研究表明存在父系遗传现象[6]。在近缘种间和种内群体间具有丰富的多态性，是探究动物群体遗传多样性和追踪家养动物起源的载体。Y 染色体分子遗传标记一般是指Y 染色体上非重组区的标记，具有遵循父系遗传、不与X 染色体重组、突变率比mt DNA 低等特点，是进化事件的忠实记录者，可以反映父系对驯化哺乳动物基因池的贡献[7]。由于分子标记类型不同、绵羊种群不同、实验数据处理方式不同等因素，使多数研究结果缺乏可比性；其次，部分品种的引种繁育[8]，绵羊品种研究证据不够充分，使得绵羊品种的遗传多样性工作与群体遗传结构分析工作进展较为缓慢。

2 绵羊品种遗传多样性方法与技术探索

基于对传统研究方法受基因表达和环境共同影响，相比之下分子标记可直接反映核酸水平的遗传变异。分析方法都基于对同源序列的相似性分析，同源序列是指从某一共同祖先经过趋异进化而形成的不同序列，相似性是指序列比对过程中检测序列和目标序列之间相同碱基或氨基酸残基序列所占比例的大小，是序列之间相关的一种量度，两序列的相似性可以基于序列的一致性的百分比[9]。第一代分子标记分析方法主要是限制性片段长度多态性 （RFLP） 分析；第二代分子标记分析方法主要是微卫星DAN 分析；第三代分子标记分析方法主要是单核苷酸多态性 （SNP） 分析。现有发表的文献中，以锡林郭勒绵羊羊各品种为样本进行品种遗传多样性的研究成果较少，且对察哈尔羊进行遗传多样性研究的文献暂时未找到，所以需参照其他品种的研究成果来进行论述。

2.1 限制性片段长度多态性 （RFLP）

限制性片段长度多态性 (RFLP) 标记是发展最早的DNA 标记技术，基本原理是将染色体组DNA 用特定的限制性内切酶识别并切割，产生很多长度不相同的核苷酸片段[10]，是研究动物群体间亲缘关系及群体遗传多样性的有效途径，已广泛应用于家畜起源进化、亲缘关系、畜禽群体的遗传结构及考察畜禽地方品种遗传资源多样性的研究中[11]。巩元芳[12]等对9 个绵羊品种用RFLP 分为4 个单倍型，单倍型Ⅰ在品种间和品种内均有分布，但比例不同；滩羊、小尾寒羊和乌珠穆沁羊以单倍型Ⅰ为主，但仍有其他单倍型。李祥龙[13]等采集9 个地方绵羊品种，对样本的mt DNA 的 D-loop 区进行 RFLP 分析，结果表明，湖羊、蒙古羊、乌珠穆沁羊的多数个体属于单体型Ⅰ，且单体型Ⅰ和Ⅱ在品种间和品种内均有分布。古丽格娜[14]对7 种绵羊和4 种山羊GDF9 基因G1 突变基因型进行PCR-RFLP分析，检测到两种基因型，将11 种羊分为杂合型 （AB） 和纯合型 （AA），其中内蒙古绒山羊仅检测到 AA 型，其余 10 个绵羊和山羊品种均检测到AA、AB 两种基因型。陈静茹[15]等利用PCR-RFLP 技术，准确鉴定了食品中多趾北京油鸡肉与华都艾拔益加肉鸡是家禽品种鉴别的成功案例。

综合分析RFLP 对绵羊品种区分的各个研究成果，RFLP 只能检测到部分不同序列位点，且DNA 链的二级结构还容易造成人工假象，使测序结果出现偏差，常出现划分不清晰，无法区分或区分混乱的结果，需要更精细更清晰的品种遗传多样性分析方法。

2.2 微卫星

微卫星也称简单串联重复序列，一般由2～6bp 组成核心序列，重复 10～20 次，首尾相接而组成。因其数量多、分布广、保守性强的特性，是各类遗传标记方法中极有价值的方法之一，常用于畜牧种群分子水平上遗传结构的研究［16］。马月辉等［17］对 12 个中国地方绵羊品种及一个外来品种，选取 30 个微卫星标记进行遗传多样性研究发现，苏尼特羊和乌珠穆沁羊首先聚为一类，滩羊和小尾寒羊聚为一类，然后这4 个品种作为一个分支聚为一类。郭小雅等［18］分析了我国 6 个绵羊山、羊品种的遗传分化，进一步证明了乌珠穆沁羊和小尾寒羊、滩羊、湖羊、同羊有较近的亲缘关系，共同归属于 “蒙古羊”系。耿岩等［19］利用微卫星法分析了中国蒙系 6 个绵羊品种，当用NJ 法构建系统发生树时，滩羊和乌珠穆沁羊最先聚在一起，后与小尾寒羊聚为一类；当用UPGMA 法构建系统发生树时，小尾寒羊与乌珠穆沁羊最先聚在一起，不同的分析统计方法得出不同的分析结果。仲涛等［20］采用 21 个微卫星座位，运用DA 遗传距离将9 个地方绵羊品种进行分类，其中属于蒙古羊系的乌珠穆沁羊、呼伦贝尔羊、滩羊和湖羊聚为一类。侯冠彧［21］等利用 30 个 SSR 标记，对 6 个绵羊品种共 237 个体进行遗传多样性分析，系统发生树将6 个绵羊品种划为4 个分支，其中苏尼特羊和乌珠穆沁羊为一支、内蒙古细毛羊和小尾寒羊为一支；并进一步对6 绵羊品种的NJ 法和UPGMA 法聚类构建系统发育树，树中乌珠穆沁羊和苏尼特羊是蒙古羊分化最晚的2 只；由于2 个品种地理位置、气候条件、饲养方式等都比较接近，受人文环境影响又很类似，加上有些类群长期的无目的杂交育种，最后导致2 个群体的同质性增加，遗传距离减小。陈李鹏［22］等对 6 个绵羊品种，用 6 个微卫星座位对 280个个体进行遗传多样性分析；计算了6 个绵羊品种间的多态信息含量、杂合度和遗传距离，并进行了主成分分析和UPGMA聚类；呼伦贝尔羊与乌珠穆沁羊遗传距离最小，首先聚为一类，它们均来自内蒙古，生活环境极为相似，均是在当地长期的自然和人工选择情况下而逐渐育成的肉脂兼用型绵羊品种。

综合分析各研究成果表明，苏尼特羊、呼伦贝尔羊、乌珠穆沁羊、小尾寒羊等品种均隶属于蒙古羊系统，起源于共同的祖先群体而亲缘关系相对较近，许多研究也证实了这一观点。因起源相近，受自然条件与人为因素的影响又极为类似，使得同质性较高。在当前微卫星的研究中，其量化方法存在争议，因数据统计分析方法直接影响分析结果，需要用更准确的分析统计方法来做进一步的分析及讨论。

2.3 单核苷酸多态性 (SNP)

全称 Single Nucleotide Polymorphisms，指在基因组上单个核苷酸的变异 （包括置换、颠换、缺失和插入），形成遗传标记，具有数量多，分布广泛，多态性丰富，易于快速、规模化筛查，便于基因分型等特点，其作为新的遗传标记对基因定位及相关疾病研究的意义亦非常重大[23]。目前SNP 的检测方法有很多，基于PCR 技术的RADP 法、AFLP 法和单链构象多态性 （SSCP），直接测序的方法，基于杂交的方法及毛细管电泳法等[24]。赵倩君等[25]对8 个绵羊的线粒体D-loop 全序列进行了测序分析后构建系统发育树，将中国绵羊分为3 大支系，除南非肉用美利奴羊的7 绵羊群体在3 个支系中均有分布，而南非肉用美利奴羊仅在支系B 中检测到品种间无明显区分。巩元芳等[26]利用RAPD 标记分析10 个绵羊品种得出的遗传多样性，蒙古羊与湖羊首先聚一起，而后与乌珠穆沁羊聚为一类，表现出这几种地方绵羊品种有较近的亲缘关系，并与其所处的地理位置也表现一定的相关性。赵兴波等[27]采用PCR-SSCP技术对7 个绵羊品种mt DNA 控制区5′端序列分析发现，可分为突变型和野生型，且不同品种绵羊在两个类型中均有分布，不能作为品种的特征性差别。袁泽湖等[28]使用11 个绵羊品种的 SNP 芯片数据，应用 PCA、NETVIEW、STRUCTURE、NJ 树等方法对群体结构进行分析，PCA 分析能将地理起源的不同个体分开[29,30]其中乌珠穆沁羊与湖羊、同羊等聚为一类，NETVIEW 分析也印证了PCA 的结果，乌珠穆沁羊与哈萨克羊罗布羊有较近的亲缘关系，STRUCTURE 分析乌珠穆沁羊与藏羊，二者无明显分化，NJ 分析中，罗布羊和乌珠穆沁羊的遗传分化系数最低。黄丹丽等[31]利用PCR-SSCP 技术检测乌珠穆沁羊123 个样本的FSHR 基因第10 外显子的 SNP 发现，此绵羊FSHR 基因第10 外显子序列与小尾寒羊的同源性分别为100%。刘月丽等[32]利用主成分分析 （PCA） 提取 SNP 主要位点，随后使用随机森林方法，对主位点的重要性进行评估，训练分类模型。选取重要度排名前的位点，以这些位点为分类特征，建立分类模型进行品种鉴别，减少了用于品种鉴别的SNP位点个数，降低了品种鉴别成本，为今后SNP 分析提供新的位点筛选方法。

目前，国内在动物品种遗传多样性分析领域中对SNP 的研究处于快速发展阶段，多数用于人体病变、动物育种、生理性状等方面，在动物类研究中关于猪、鸡方面的报道较多，而研究羊的较少，存在广阔的发展空间。而SNP 在绵羊研究中，多数是针对性状与育种方面。研究表明，部分基因的SNP 位点与个体的发育性状有关，可以将此类基因作为选育生长发育性状的分子遗传标记[33]。随着育种与社会需求的增加，将加速SNP分子标记技术在绵羊育种分子遗传标记在绵羊育种、遗传分析中的应用。

3 锡林郭勒绵羊品种遗传多样性分析展望

锡林郭勒绵羊在遗传多态性和品种分化方面的研究仍比较薄弱，还没有足够的来自遗传学和分子生物学方面的信息，很难对锡林郭勒绵绵羊进行更加深入、全面的分析和认识。人工选择、迁移、突变等生物技术的应用不同程度地导致群体遗传结构的改变，这些均会给研究分析带来影响。而不同研究方法，不同遗传标记、不同聚类方法会产生不同甚至相矛盾的结果，所以需开发新的新的研究方法或模型，整合各影响因素，使实验结果趋于统一，分析研究更准确完善。

在今后工作中建议从以下几个方面开展研究：(1) 加大研究样本的品种与数量，使各品种的研究分析结果具有代表性；(2) 尽量结合多种遗传标记与遗传分析方法，增加研究的普遍性；(3) 利用先进的测序技术对mt DNA、Y 染色体和常染色体进行全面剖析，探索更便于分析研究的基因序列；(4) 开发较为完善的数据分析模型，使得数据分析更为准确。