自花和异花授粉对蓝莓花粉管动力学的影响*

杨 芩，罗 莉，罗 娅，刘雅兰，张婷渟，彭 舒

（1凯里学院大健康学院，贵州556000）（2凯里学院蓝莓研究所）

自交不亲和性为高等植物为了实现遗传重组和保持遗传变异的一种重要机制[1]，基于遗传决定方式可分为孢子体自交不亲和性（SSI）与配子体自交不亲和性（GSI）[2]。SSI的表型由孢子体的S基因型决定，主要表现为花粉在柱头乳突细胞表面不能正常萌发，或萌发后在柱头乳突细胞上弯曲生长而不能进入花柱组织；GSI的表型则是由花粉自身的单倍体基因所决定，主要表现为花粉管通常在花柱组织，或花粉管与胚囊组织间停止生长[3-4]。前人研究表明，梨[5-6]、苹果[6-7]、李[8]和枇杷[9]等蔷薇科果树均属于 GSI类型。蓝莓属杜鹃花科越橘属（Vacciniumspp.）多年生落叶或常绿灌木果树[10]，蓝莓大多为自花授粉结实率极低或不结实，多数品种具自交不亲和性[11-12]。因此，在生产栽培中需多品种搭配建园，以保证坐果和提高产量[13-15]。然而，迄今为止，关于蓝莓自交不亲和性的花粉管动力学研究鲜有报道。

本研究以‘园蓝’和‘蓝金’2个品种为试材，开展自花和异花授粉，采用荧光显微观察方法研究自花和异花授粉后不同时间花粉萌发、花粉管生长至花柱上部、中部和基部的花柱比率，分析自花和异花授粉对参试品种花粉管动力学的影响，以期为深入认识蓝莓授粉受精生物学特性及自交不亲和生物学机制积累基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以种植于凯里学院卓越农林人才培养实训基地内5年生的兔眼蓝莓‘园蓝’和北高丛蓝莓‘蓝金’为试材，每个品种随机选取20株生长健壮、无病虫害、长势一致的作为参试植株，异花授粉花粉采自同园内5年生的兔眼蓝莓品种‘灿烂’。

1.2 试验方法

1.2.1花粉收集与授粉

2018年3月16—29日盛花期，在参试植株树冠外围中上部选取长势一致的中果枝[10]，大蕾期花去雄后，其余花疏掉，然后用尼龙网袋套袋隔离，每个授粉处理组合共去雄540朵。去雄后第3 d，将2.0 mL的离心管放置于‘园蓝’或‘蓝金’花冠的正下方，用镊子轻轻碰撞花冠收集花粉[13]，然后镊子头蘸满花粉，轻触柱头几次，进行自花授粉，至柱头表面明显观察到花粉为止；采用相同的方法用‘灿烂’的花粉进行异花授粉。授粉后立即用尼龙网袋套袋隔离。

1.2.2材料收集与固定

参照枇杷花粉管动力学研究方法[16]，授粉后第2、4、8、12、24、48、72、96、120 h取样，然后立即用FAA（38%甲醛∶冰醋酸∶70%酒精=5∶5∶90）固定处理，每个授粉组合采集60朵花，每20朵花为1次重复，共3次重复。

1.2.3软化处理与荧光显微观察

按照杨芩等[17]的方法，用解剖刀和解剖针将各授粉组合经FAA固定预处理的花柱和子房分离，分别装入10 mL的小玻璃瓶中，然后用1 mol/L NaOH溶液在常温下软化处理，处理期间每天观察1次，花柱和胚珠透明后立即用蒸馏水清洗2～3次，然后加入0.1%苯胺蓝染色液染色48 h；染色后的花柱和胚珠压片，置于OLYMPUS-BX53型荧光显微镜下观察，用DP70摄像头拍照，统计分析自花和异花授粉后被花粉管生长穿过上部、中部和基部的花柱比率，以及胚囊活力情况。

1.3 数据统计分析

试验数据采用Excel进行整理与统计后，将所有百分率数据进行反正弦转换，所有数据采用SPSS 16.0软件中的SNK检验在5%水平下进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 自花授粉和异花授粉对花粉管生长穿过花柱上部的影响

从图1可以看出，在授粉后2 h或4 h，参试品种无论是异花授粉还是自花授粉，花粉管均未能生长至花柱上部。各授粉组合至授粉后8 h均可在花柱上部观察到花粉管，‘园蓝’和‘蓝金’均表现出异花授粉后被花粉管生长穿过上部的花柱比率显著高于自花授粉。随授粉时间的延长，各授粉组合被花粉管生长穿过花柱上部的花柱比率均逐渐增加，至授粉后48 h，被花粉管生长穿过上部的花柱比率均高于75%，同一品种内异花授粉中被花粉管生长穿过上部的花柱比率显著高于自花授粉。在授粉后72～120 h，被花粉管生长穿过上部的花柱比率同品种自花和异花授粉组合间差异不显著。在授粉后120 h，各授粉组合被花粉管生长至花柱上部的花柱比率均达到98%。

2.2 自花授粉和异花授粉对花粉管生长穿过花柱中部的影响

图1 ‘园蓝’和‘蓝金’自花授粉与异花授粉后2～120 h花粉管生长至花柱上部的比率比较

从图2可以看出，授粉后12 h内，‘园蓝’与‘蓝金’自花授粉和异花授粉处理未发现有花粉管能生长至花柱中部。授粉后24 h，‘园蓝’自花授粉花粉管生长至中部的花柱比率仅为12%，显著低于异花授粉的48%；‘蓝金’自花授粉花粉管生长至中部的花柱比率为22%，显著低于异花授粉的43%，‘蓝金’自花授粉处理的花粉管生长至中部的花柱比率显著高于‘园蓝’的自花授粉。在授粉后72 h，各授粉组合花粉管生长至中部的花柱比率均在65%以上，异花授粉后花粉管生长至花柱中部的花柱比率仍显著高于自花授粉。授粉后96 h，各授粉处理组合花粉管生长至花柱中部的花柱比率均达到90%，且至授粉后120 h，各授粉处理组合差异均不显著。

图2 ‘园蓝’和‘蓝金’自花授粉与异花授粉后2～120 h花粉管生长至花柱中部的比率比较

2.3 自花授粉和异花授粉对花粉管生长穿过花柱基部的影响

从图3可以看出，‘园蓝’与‘蓝金’自花授粉和异花授粉后24 h内未发现有花粉管生长至花柱基部。授粉后48 h，‘园蓝’与‘蓝金’异花授粉处理观察到少量花柱基部有花粉管，自花授粉处理的花柱基部均未观察到花粉管。授粉后72 h，‘园蓝’和‘蓝金’异花授粉处理的花柱基部观察到花粉管的比率均高于60%，自花授粉处理仅有25%左右的花柱基部被花粉管生长穿过。值得注意的是，至授粉后120 h，‘蓝金’自花和异花授粉处理的花柱基部被花粉管生长穿过的比率无显著性差异，均超过95%；‘园蓝’异花授粉处理花粉管生长至基部的花柱比率显著高于自花授粉，自花授粉处理的比率仅为32%，花柱基部为‘园蓝’自花授粉花粉管停止生长的关键部位。

图3 ‘园蓝’和‘蓝金’自花授粉与异花授粉后2～120 h花粉管生长至花柱基部的比率比较

2.4 自花授粉和异花授粉后对花粉管生长至胚珠的影响

从图4可以看出，在授粉后72 h，各授粉组合处理均能在胚珠中观察到花粉管，自花授粉处理‘园蓝’比率为3.33%、‘蓝金’为8.67%，异花授粉处理‘园蓝’为15.33%、‘蓝金’为13.33%，同一品种异花授粉处理胚珠中出现花粉管的比率显著高于自花授粉。在授粉后96 h，‘园蓝’异花授粉处理30.67%的胚珠中可以观察到花粉管，显著高于自花授粉的9.33%；‘蓝金’异花授粉处理29.33%的胚珠中可以观察到花粉管，显著高于自花授粉的26.00%。授粉后120 h，‘蓝金’异花授粉处理胚珠中出现花粉管的比率为43.33%，显著高于自花授粉的34.00%；‘园蓝’异花授粉处理胚珠中出现花粉管的比率为36.67%，显著高于自花授粉的18.67%。但值得注意的是，‘园蓝’自花授粉处理胚珠中有花粉管的比率仅为18.67%，显著低于‘蓝金’自花授粉的34.00%。

图4 ‘园蓝’和‘蓝金’自花授粉与异花授粉后2～120 h胚珠中出现花粉管的比率比较

2.5 自花授粉和异花授粉后对胚珠有胼胝质的影响

从图5可以看出，在授粉后2 h，‘园蓝’与‘蓝金’的自花和异花授粉均有胼胝质出现，胚珠中有胼胝质的比率为16%～30%，‘园蓝’胚珠中出现胼胝质的比率显著高于‘蓝金’。随着时间的延长，各处理胚珠出现胼胝质的比率逐渐增加。在授粉后48 h，‘园蓝’和‘蓝金’异花授粉处理胚珠中出现胼胝质的比率分别为47.33%和34.67%；授粉后48～120 h，‘园蓝’自花授粉处理的胚珠中出现胼胝质的比率均显著高于异花授粉处理，‘蓝金’自花和异花授粉处理胚珠中出现胼胝质的比率均差异不显著。

图5 ‘园蓝’和‘蓝金’自花授粉与异花授粉后2～120 h胚珠中出现胼胝质的比率比较

2.6 自花授粉与异花授粉受精进程

荧光显微观察图片（图6）显示，‘园蓝’和‘蓝金’自花和异花授粉花粉管在花柱中均有胼胝质出现，但自花授粉处理的胼胝质明显多于异花授粉，且自花授粉处理的胼胝质主要出现在花柱上部，随花粉管的生长，在花柱中部和基部花粉管上附着的胼胝质明显减少。值得关注的是，‘园蓝’自花授粉的花粉管在花柱基部停止生长，且花柱基部组织中出现大量的胼胝质，而‘园蓝’异花和‘蓝金’自花与异花授粉处理的花粉管均能顺利穿过整个花柱，同时2个品种异花授粉处理的花柱基部未发现胼胝质。结果表明，‘园蓝’自花授粉后表现出典型的配子体自交不亲和中的合子前不亲和类型，而‘蓝金’自花授粉后未表现出自交不亲和性。

图6 ‘园蓝’和‘蓝金’自花授粉与异花授粉后120 h花粉管生长的荧光显微图

3 讨论与结论

长期以来，国内外学者和蓝莓种植者熟知，高丛蓝莓、兔眼蓝莓和矮丛蓝莓等栽培类型的品种大多具有自交不亲和性，自花授粉不结实或结实率较低[11,13,18-20]，多品种搭配建园是保证和提高其产量的必要条件[21]，但关于蓝莓自花和异花授粉对花粉管动力学影响的研究至今鲜有报道。本研究发现，‘园蓝’和‘蓝金’自花授粉后花粉管均能够顺利地穿过柱头乳突细胞进入花柱，且与欧洲李[22]、枣[23]、杏李[24]、草原樱桃[25]等果树授粉不亲和现象类似，花粉管在花柱中生长伴随大量的胼胝质出现。然而，胼胝质出现的部位却有明显差异，本研究发现，‘园蓝’和‘蓝金’自花授粉后，胼胝质主要附着在处于花柱上部的花粉管上，‘园蓝’花柱基部亦出现大量胼胝质，而枣[23]自花授粉则在花柱基部和子房出现大量胼胝质，杏李[24]自花授粉后则在花柱柱头、花柱中上部和子房室胚珠附近处有胼胝质出现。

本研究发现，与欧洲李[22]、枣[23]、杏李[24]、草原樱桃[25]等果树授粉不亲和花粉管生长的规律不同，‘园蓝’自花授粉后花粉管生长至花柱上部时虽附着大量胼胝质，但仍能继续生长至花柱中下部，且除了顶端变细外未出现弯曲和顶端膨大现象，而欧洲李[22]则在花柱中上部出现花粉管弯曲和膨大现象，杏李[24]花粉管进入柱头后出现团状缠绕，并伴有顶端变细和在花柱中生长出现回折的现象，梨[26]花粉管在花柱内表现为扭曲变形、杂乱无章和末端变粗膨大等现象，然而最后的结果是都导致了自花的花粉管停止生长。‘园蓝’这种自花花粉管在花柱中停止生长的现象是否像蔷薇科果树一样归因于自花花粉管中的RNA被花柱S-RNase所降解，或归因于蛋白激酶和磷酸酯酶之间的相互作用，引起自花花粉发生程序化死亡，导致花粉管在花柱中停止生长[27]至今不得而知。因此，蓝莓花粉管在花柱中停止生长的原因急需阐明，为进一步认识蓝莓自交不亲和机制的重要研究方向。

本研究同时发现，‘园蓝’和‘蓝金’用‘灿烂’异花授粉的花粉管分别在授粉后48 h和72 h可以生长至花柱的基部和胚珠，生长至花柱基部和胚珠所需时间均长于李菊馨等[28]在‘密斯蒂’蓝莓授粉亲和性研究中发现的24 h和48 h。这可能归因于不同品种，或不同发育时期自交不亲和基因表达的时空差异[16,29]。此外，本研究表明，参试品种异花授粉的花粉管生长速度快于自花授粉，这与‘密斯蒂’[28]自花和异花授粉花粉管生长速度一致的结果有差异，但与自花和异花授粉对‘寒富’苹果[30]和‘华硕’油茶[31]花粉管动力学的影响结果一致。这可能归因于本研究授粉试验在大蕾期去雄，去雄后第3 d授粉时为自交不亲和基因在花柱内表达最强的时期，从而抑制了自花花粉管的生长[16,32]。此外，在授粉后72 h，‘园蓝’自花授粉的胚珠出现胼胝质的比率显著高于异花授粉，而‘蓝金’自花授粉的胚珠出现胼胝质的比率与异花授粉差异不显著，这表明自花授粉处理可能加速了胚珠的退化[16]，但具体原因仍有待进一步深入研究。