血浆Septin9甲基化在肝癌鉴别诊断中的临床价值*

2020-12-15沈志明颜光涛

国际检验医学杂志 2020年23期

沈志明,冯杰，魏静，颜光涛△

(1.赣南医学院第一附属医院检验科，江西赣州 341000；2.解放军总医院医学检验中心，北京 100853)

原发性肝癌(简称肝癌)在我国常见恶性肿瘤中居第4位，在肿瘤致死病因中居第3位，严重威胁我国人民的生命和健康[1-2]。我国每年死于肝癌的患者约35万人，占全世界肝癌死亡人数的50%以上[3]。肝癌的病理类型主要包括肝细胞癌、胆管细胞癌和兼有两者的混合细胞型肝癌，各型的发病机制、组织学形态、生物学行为、治疗方法及预后等方面均有明显的不同[4]。其中肝细胞癌和胆管细胞癌占比较高，目前肝细胞癌及胆管细胞癌的影像学表现类似，且两者都表现为肝内占位，因为两者治疗和预后不同，临床上辅助其他血液检验手段充分进行鉴别对其治疗方案的选择至关重要。近年的研究表明,SEPT家族某些成员尤其Septin9与肿瘤的发生直接相关,其功能研究正逐渐成为恶性肿瘤发生机制研究的新热点[5]。但在肝癌中报道的比较少。本文通过探究血浆Septin9甲基化和其他指标联合检测在肝癌筛查中的临床意义，为肝癌的筛查和鉴别诊断提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料随机选取2018年11月至2019年11月在解放军总医院确诊且临床病理资料完整的肝细胞癌患者175例和胆管细胞癌患者101例分别纳入肝细胞癌组、胆管细胞癌组，并选取该院同期体检健康人员163例为健康对照组。175例肝细胞癌组患者中男144例，女31例；101例胆管细胞癌组患者中男58例，女43例；163例健康对照组中男108例，女55例。3组之间年龄差异无统计学意义(P>0.05)。纳入标准：(1)首次发现并在解放军总医院住院治疗，没有接受任何放化疗；(2)住院期间通过肝穿刺检查并取活体组织行病理诊断，依据《美国癌症分期联合会(AJCC)癌症分期手册(第7版)》明确肝细胞癌和胆管细胞癌诊断；(3)住院后测定血清总胆红素 (TBIL)、直接胆红素 (DBIL)、丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶 (AST)、碱性磷酸酶 (ALP)、谷氨酰转移酶(GGT)、血清总蛋白(TP)、血清清蛋白(ALB)水平及肿瘤标志物甲胎蛋白(AFP)、糖类抗原153(CA153)、糖类抗原199(CA199)、糖类抗原125(CA125)和血浆Septin9甲基化。排除标准：(1)有免疫系统疾病史者；(2)急性或慢性炎症感染者；(3)合并其他原发性肿瘤患者；(4)其他肿瘤转移性肝癌患者。本研究通过了解放军总医院伦理委员会审查。

1.2方法所有患者都于住院后治疗前采静脉血送检，通过临床电子病历系统收集患者性别、年龄等一般资料和检验相关指标，肝功能项目在罗氏C701分析仪上检测，其中ALP、GGT、ALT、AST、TP、ALB 使用原装试剂，TBIL、DBIL 使用和光纯耀试剂。肿瘤标志物项目在罗氏e601分析仪上采用原装试剂检测。血浆Septin9甲基化采用实时荧光定量PCR法进行检测，具体操作参考试剂盒说明书。测试标本内参基因β-actin的Ct值≤32.1时为判定有效，试剂盒提供了阳性和阴性对照。

2 结果

2.1各组间血浆Septin9甲基化阳性表达率比较肝细胞癌组Septin9甲基化阳性表达108例，阴性表达67例，阳性表达率为61.7%；胆管细胞癌组Septin9甲基化阳性表达40例，阴性表达61例，阳性表达率为39.6%；健康对照组阳性表达率为0.0%，两两组间阳性率比较差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 各组间血浆Septin9甲基化阳性表达率

2.23组间肝功能和肿瘤标志物检测指标比较除年龄外，3组间男女发病比例、肝功能、肿瘤标志物比较差异均有统计学意义(P<0.01)。胆管细胞癌组ALT、AST、TBIL、DBIL、ALP、GGT、CA199、CA125、CA153水平高于肝细胞癌组和健康对照组(P<0.01)，其ALB水平低于肝细胞癌组和健康对照组(P<0.01)，TP、AFP水平则低于肝细胞癌组(P<0.05)。肝细胞癌组ALT、AST、TBIL、DBIL、ALP、GGT、AFP、CA199、CA125水平高于健康对照组(P<0.01)，其ALB水平则低于健康对照组(P<0.01)。见表2。

表2 3组一般资料、肝功能、肿瘤标志物检测指标比较

2.3肝癌危险因素的Logistic回归分析通过SPSS21.0 统计软件对纳入的肝功能指标、血浆Septin9甲基化水平及肿瘤标志物进行二分类Logistic回归分析，采用Backward：LR方式进行指标筛选，发现GGT和血浆Septin9甲基化检测在回归模型中有统计学意义(P<0.01)，通过GGT和血浆Septin9甲基化检测建立二分类Logistic回归模型，此模型对肝细胞癌和胆管细胞癌的鉴别诊断准确率为78.3%。见表3。

表3 基于GGT和血浆Septin9甲基化检测建立二分类Logistic回归模型

2.4GGT和血浆Septin9甲基化检测对肝癌的鉴别诊断价值 GGT和Septin9甲基化联合鉴别诊断肝细胞癌的AUC为0.845(95%CI：0.797～0.893)，明显优于GGT的0.779(95%CI：0.718～0.841)和Septin9甲基化的0.611(95%CI：0.541～0.680)(均P<0.05)，见图1。两指标联合检测取约登指数最大时灵敏度为88.6%，特异度为68.3%，优于GGT、Septin9单独检测时的灵敏度(84.0%、61.7%)、特异度(67.3%、60.4%)。

图1 基于GGT、Septin9及其组合的ROC曲线

3 讨论

Septin9基因位于17q25.3，主要编码Septin9甲基化，其主要生物学功能参与细胞骨架结构形成及细胞质分裂。Septin9基因的突变导致细胞基因组的不稳定，并容易转化为肿瘤[6]。有基因芯片检测分析表明,除了在结直肠癌中高表达,Septin9还在卵巢、中枢神经系统、乳腺、甲状腺、膀胱和前列腺等来源的实体肿瘤中高表达[7-8]。目前致癌的发病理论“腺瘤→癌变”学说主要是指染色体不稳定、微环境不稳定及胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)岛上甲基化这3种致病机制[9-10]。至于导致癌变的原因有可能是其中一种或多种机制组合而成，但可以明确位于CpG岛上的基因启动子约占人类基因启动子的一半，使其成为癌变的主要原因。它们诱导癌症共同的途径都是异常基因甲基化导致相应基因的异常表达，主要特定癌症相关基因(尤其是肿瘤抑制基因)，最后导致正常生理功能紊乱。部分文献研究已明确表明Septin9基因在结直肠癌发生、发展中起重要作用[11-13]。夏常青等[14]研究表明Septin9甲基化阳性率为73.4%，证实血浆Septin9甲基化在结直肠癌诊断中具有重要价值。本研究中肝细胞癌组Septin9甲基化阳性表达率[61.7%(108/175)]高于胆管细胞癌组[39.6%(40/61)]和健康对照组(0.0%)，差异有统计学意义(P<0.01)。因此，Septin9甲基化在肝癌发生、发展过程中也充当了非常重要的角色，甚至可以推测在肝癌发展过程中，Septin9基因同样起到了抑癌基因的作用。Septin9甲基化抑制了该基因的正常表达，导致其肿瘤抑制功能丧失，最终致异常肝细胞过度表达，导致肝癌的发生。鉴于Septin9甲基化在肝癌中的高阳性率，可以通过检测血浆Septin9甲基化水平，用于肝细胞癌早筛和诊断，同时也有助于其与胆管细胞癌的鉴别诊断。相比常规检测肿瘤的方法，如X线检查、病理活检、细胞穿刺等，前者存在辐射，后两个为有创检查。检测Septin9甲基化进行肝癌筛查和早期诊断可以做到早期发现、早期治疗，且无创，容易普及，可以动态监测，有望成为肝细胞癌的新肿瘤标志物。

GGT属于一种质膜结合糖蛋白，广泛分布于肾脏、肝脏、胰腺、肠等人体内多种组织中，其和TBIL、DBIL和ALP升高可见于梗阻性黄疸、胆汁淤积性肝炎和肝癌等疾病中。健康人血清GGT来源于肝脏，主要存在于肝细胞膜和微粒体上，广泛分布于肝细胞的毛细胆管一侧和整个胆管系统，参与谷胱甘肽的代谢[15]。当肝内合成亢进或胆汁排泄障碍时，特别是酒精性肝病或肝脏胆管肿瘤，血清中GGT升高[16]。本研究发现在肝细胞癌组和胆管细胞癌组中ALT、AST、TBIL、DBIL、ALP、GGT高于健康对照组，同时胆管细胞癌组较肝细胞癌组更高(P<0.01)。由于胆管细胞癌为来源于胆道上皮细胞的恶性肿瘤，可发生于胆道系统的各级胆管，其较肝细胞癌更容易出现胆道梗阻和胆汁排泄障碍，因此，ALT、AST、TBIL、DBIL、ALP、GGT在胆管细胞癌组升高更为明显。其中GGT升高最为明显，升高的程度和胆道梗阻程度相关，成为鉴别诊断胆管细胞癌的重要指标。同时肿瘤标志物CA199是一种低聚糖类肿瘤相关的糖类抗原，血清CA199明显增高可出现在消化系统肿瘤患者中，其水平可为正常均值的535倍[17]，本研究显示肝细胞癌组CA199、CA125、CA153低于胆管细胞癌组(P<0.01)，而胆管细胞癌组CA199升高最明显，CA125、CA153次之。

研究表明，AFP是目前临床应用最广的早期检测肝细胞癌的指标[18]。然而单一AFP检测存在假阳性率较高及部分患者AFP正常或偏低等假阴性缺点[19]。因此，积极寻找诊断肝癌的重要指标和特异度强的肿瘤标志物具有重要意义。本研究肝细胞癌组TP、ALB 、AFP高于胆管细胞癌组(P<0.01)，证实AFP在诊断肝细胞癌中确实发挥重要作用，而蛋白相对高说明肝细胞癌营养状况相比胆管细胞癌更好。本研究中GGT和血浆Septin9甲基化检测在回归模型中具有统计学意义(P<0.05)，发现GGT和血浆Septin9甲基化联合检测具有更高的价值，联合检测的AUC为0.845(95%CI：0.797～0.893)，约登指数最大时的灵敏度为88.6%，特异度为68.3%。该模型对肝细胞癌和胆管细胞癌的鉴别诊断准确率为78.3%，均优于单一指标检测的诊断价值。因此，GGT和血浆Septin9甲基化两者联合检测可为肝癌的早期鉴别及诊断提供一定的参考依据，可以作为肝癌早期筛查和诊断新的肿瘤标志物。关于血浆Septin9甲基化阳性率与肝癌的研究鲜有报道，本研究纳入的研究对象较少，设计存在一定局限性，病理金标准的一致性和各指标组合性能验证需要进一步深入研究。