APP下载

破膜剂对流式细胞术检测小肠中ILC3频率的影响*

2020-12-15张晓敏王培昌

国际检验医学杂志 2020年23期
关键词:破膜小肠染色

曹 敏,张晓敏,王培昌,刘 静

(首都医科大学宣武医院检验科,北京 100053)

固有淋巴样细胞(ILCs)是最近发现的一种天然免疫细胞,ILCs是由造血干细胞(HSC)分化而来,HSC向ILCs分化的途径为:长期造血干细胞(LT-HSCs)→ 短期造血干细胞(ST-HSCs)→多能祖细胞(MPPs)→共同淋系祖细胞(CLP )→髓样淋巴祖细胞(CMP)→ILC前体细胞(ILCP)→各类ILCs[1]。ILCs主要分为3个亚群:ILC1亚群(ILC1s)、ILC2亚群(ILC2s)和ILC3亚群(ILC3s)[2]。目前研究认为,ILC1s存在于肠道和肝脏中,在病毒感染早期及肝脏损伤中发挥免疫作用[3-4];ILC2s主要存在与肠道、肺部和血液中,与哮喘、过敏性皮炎有关[5-6];ILC3s主要存在于淋巴结和肠道中,在炎症性肠病及清除胞内寄生菌感染中发挥免疫作用[7-8]。目前检测小肠组织中ILC3频率的方法主要依靠流式细胞术结合胞内染色,但是在染色过程中诸多因素会影响检测结果。由于小肠中ILC3含量较少且含有胞内抗原,需对其固定破膜后染色,固定破膜效果如何将成为影响小肠中ILC3检测水平的一项重要因素[9]。本研究中,课题组比较不同厂家的破膜试剂(BD公司破膜剂、eBioscience公司破膜剂、联科生物公司破膜剂)对小肠中ILC3检测效率的影响,目的在于提高小肠组织中ILC3检出频率,为后续实验奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物实验小鼠 均为无特定病原体(SPF)级雌性小鼠(月龄3个月),体质量(20±5)g,购自北京华阜康生物科技股份有限公司。

1.1.2仪器 Gallios流式细胞仪(美国 Beckman公司),高速冷冻离心机(美国Thermo Scientific公司),1 mL注射器、1.5 mL、50 mL离心管(北京兰博利德商贸有限公司),200目尼龙纱网、流式细胞仪试管(美国BD公司)。

1.1.3试剂 eBioscience公司Transcription Factor Staining Buffer Set破膜剂(货号:00-5523-00),BD公司Cytofix/Cytoperm破膜剂(货号:554714),联科生物公司Fix&Perm Kit破膜剂(货号:70-GAS003)。抗小鼠Lin-405、抗小鼠CD45-FITC、抗小鼠CD127-PECy7、抗小鼠RORγt-APC购自eBioscience公司。3.5%水合氯醛、10×磷酸盐缓冲液(PBS)干粉、Hank′s平衡盐溶液(HBSS)、5 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)、胶原酶、Dnase I购自北京索莱宝科技有限公司,胎牛血清购自以色列Biological Industries公司。

1.2方法

1.2.1小肠组织单细胞悬液制备 取月龄3个月的实验小鼠,3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉后断颈处死,剪开腹部皮肤,暴露腹腔脏器,用手术剪在胃与十二指肠连接处、回盲肠连接处剪断,分离全段小肠置于1%冷PBS中,剥除肠系膜并用1%冷PBS冲洗小肠,剪下小肠派尔集合淋巴结(PP结),将小肠置于5~10 mL solution Ⅰ(HBSS+5 mmol/L EDTA+10 mmol/L HEPES)中,37 ℃ 100 r/min摇床中消化15~20 min,重复4~5次,直至小肠组织呈无色透明状,弃上清液并收集小肠组织置于solution Ⅱ(HBSS+2%FBS+0.5 mg/mL胶原酶Ⅱ+0.5 mg/mL胶原酶Ⅲ+0.5 mg/mL DNase Ⅰ)中,再次消化,37 ℃ 100 r/min摇床中消化30 min,重复2~3次,将小肠组织消化液于200目尼龙纱网中过滤后,将上清液收集于50 mL离心管中[10]。

1.2.2细胞染色 将收集的小肠组织单细胞悬液根据使用的破膜剂分为3组:eBioscience组(EB组)、BD组、联科组(MS组)。每份标本中分别加入Lin-405、CD45-FITC、CD127-PECy7进行表面染色,冰上避光孵育1 h,3 000 r/min离心1 min,3组标本中分别加入不同公司的适量破膜剂,温度4 ℃,分10、20及60 min 3种不同处理时间,用配套的破膜洗液洗涤两遍后,在小肠组织单细胞悬液标本中分别加入RORγt-APC抗体冰上避光染色1 h,染色结束后分别加入适量配套的破膜洗液洗涤两遍,2 h内上机检测。

1.2.3样品检测与分析 开启Gallios流式细胞仪在前向角散射光(FSC)/侧向角散射光(SSC)散点图中显示细胞群,圈出淋巴细胞群,利用ISO管、单阳管调节电压、补偿等参数。在淋巴细胞群中,圈出Lin-CD45+CD127+RORγt+的ILC3[11],利用FlowJo (version 7.6)软件分析细胞群比例。

2 结 果

2.1小鼠小肠ILC3圈门策略 如图1所示,可见明显ILC3细胞群。相同破膜时间不同组别中小肠ILC3典型图如图2所示。将相同破膜时间不同破膜剂处理的ILC3检出频率进行比较,发现EB组[(19.66±0.33)%]和BD组[(20.73±0.49)%] Lin-CD45+CD127+RORγt+的ILC3检出率高于MS组[(10.79±0.25)%],差异有统计学意义(P<0.05),但BD组和EB组小肠组织中ILC3的检出频率差异无统计学意义(P>0.05),如图3所示。

注:A为小肠中淋巴细胞群分布;B为淋巴细胞群;C为Lin-细胞群;D为CD127+RORγt+的ILC3。

2.2破膜时间对检测小肠中ILC3频率的影响 3种破膜剂分别对小肠ILC3处理不同时间,结果表明,对细胞处理10 min,破膜效果较差,然而破膜60 min,破膜过度,小肠ILC3检出频率低,细胞形态受破坏。当细胞处理20 min时,破膜效果最佳,小肠中ILC3检出频率最高。见表1。

注:A为MS组小肠ILC3频率;B为EB组小肠ILC3频率;C为BD组小肠ILC3频率。

注:与MS组比较,*P<0.05;“n.s.”表示差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 破膜时间对3组破膜剂检测ILC3细胞频率的影响

2.3实验的可重复性 在相同实验条件下,同一份标本由不同操作者进行,结果差异无统计学意义(P>0.05),同一份标本由同一操作者重复2遍,CV值均小于5%。

3 讨 论

随着流式细胞技术的不断发展,流式细胞术广泛应用于各大实验室,特别是随着激光管的不断增加,荧光素的不断开发,多色流式细胞仪的应用能够更加快速准确灵敏地检测多个指标,例如在检测自然杀伤(NK)细胞和ILC1时,NK细胞与ILC1均属于第一类ILC细胞,且由于ILCs发现较晚,ILC1常与NK细胞相混淆,但由于多色流式细胞技术的发展,研究人员发现在CD3-NKp46+NK1.1+的基础上,CD49a+CD49b-的细胞是ILC1,而CD49a-CD49b+的细胞是NK细胞[12]。在原有基础上,增加两种荧光素,能够准确区分两种不同细胞,为后续实验奠定了基础。

利用流式细胞术检测细胞时,对于胞内抗原染色,细胞的固定与破膜是否恰当将严重影响染色效果,目前常用的破膜剂主要是BD Cytofix/Cytoperm试剂盒、Beckman Coulter试剂盒、eBioscience Fix & Perm试剂盒等,选择合适的破膜剂,能够更好地保持细胞的大小和完整性,增加细胞膜的通透性。本实验发现应用EB公司的破膜剂和BD公司破膜剂能够更好的检测出小肠中ILC3,在多次实验中发现,使用配套的破膜洗液洗涤细胞后,能够有效地减少非特异性结合,并提高染色效率。但延长破膜时间并没有提高破膜效率,反而由于破膜时间过长,细胞肿胀,可能会导致细胞死亡。对于低水平表达的抗原,在做配色时,应选择强荧光集团,并适当增加染色时间,以提高染色效率,同时当流式标本制作完成后,应尽快进行上机检测,减少细胞死亡,使实验结果更加准确。

本实验所研究的ILC3属于第三类ILCs,ILC3分为NKp46+的ILC3和NKp46-的淋巴样组织诱导细胞(LTi)[13],ILC3主要存在于肠道、皮肤黏膜中,受到TCF1、Notch和RUNX1等转录因子的调控[14]。ILC3主要存在于小肠固有层,产生IL-22和IL-17等细胞因子,对维持肠道免疫功能发挥重要作用[14]。在利用流式细胞仪检测小肠中ILC3时,由于RORγt属于胞内抗原,且抗原表达水平较低,本实验室选择了荧光素较强的APC做配色[15],同时选用合适的破膜剂,能够更好的检测小肠内ILC3。流式细胞术作为一项被广泛应用的实验技术,在开始正式实验前,应仔细考虑本实验的配色方案是否合理,并利用少量标本进行预实验,根据预实验结果,调整实验方法,最终获得理想的实验结果。

4 结 论

本研究通过比较不同公司破膜剂对检测小鼠小肠中ILC3频率的影响,发现EB公司破膜剂和BD公司破膜剂能提高流式细胞仪检测频率,同时验证了增加破膜时间并不能提高破膜效率。本研究比较了3种不同公司的破膜剂对检测小鼠小肠中ILC3的影响,为后续实验奠定了基础。

猜你喜欢

破膜小肠染色
一次性宫颈扩张球囊联合人工破膜及催产素静脉点滴在足月妊娠引产中的临床效果观察
节水染色和非水介质染色技术的研究进展
一根小肠一头猪
自由体位待产下两种破膜方式对分娩结局及新生儿的影响
两类图的b—染色数和研究
平面图的3-hued 染色
羊水流干对宝宝有影响吗
养好女人小肠经
油红O染色在斑马鱼体内脂质染色中的应用
破膜后羊水会不会流干?