circRNAs 对结直肠癌的抑制作用及其生物信息学分析

李 霞, 于 逸, 左海维, 周凤娟, 辛 勇

（1.徐州医科大学附属医院放疗科，江苏 徐州 221000；2.徐州医科大学生命科学学院，江苏 徐州 221000；3.徐州医科大学医学信息与工程学院，江苏 徐州 221000；4.徐州医科大学第二附属医院放疗科，江苏 徐州 221000）

结直肠癌是消化系统中最常见的恶性肿瘤之一， 其 发 病 率 在 多 种 癌 症 中 排 第4 位［1］。 环 状RNA （circular RNA， circRNA） 是一类广泛表达于真核细胞的环形RNA， 多起源于蛋白编码基因［2］。 近 年 研 究［3］显 示： circRNA 可 通 过 微 小RNA （microRNA，miRNA）“海绵” 等作用模式在基因表达中发挥重要的调控作用，且越来越多的证 据［4］表 明：circRNA 可 能 是 一 种 潜 在 的 疾 病 标志物和治疗靶点。高通量测序技术［5］发现：在结直肠癌患者肿瘤细胞和血浆中circRNA-VAPA 水平均明显升高，并且可以通过与miRNA-101 结合，呈现原癌基因活性，促进肿瘤发展。circFAT1 在结直肠癌组织中表达高于癌旁正常肠黏膜组织，体外细胞实验［5］显示：下调circFAT1 表达可明显降低肠癌细胞株迁移和侵袭能力。has_circ_0079656在结直肠癌组织中呈低表达，且随着结直肠癌病情的进展其表达水平逐步降低，其可能通过作用于HINFP 基因调控细胞周期中G1/S 期的转录过程，进而影响结直肠癌的进展［6］。与已经报道的研究不同，本课题组采用表达谱数据与生物信息分析方法发现：hsa_circ_0043278 的表达水平在结直肠癌样本中明显降低， 通过统计分析得到了与hsa_circ_0043278 结合的miRNA， 结合基因本体论（Gene Ontology，GO） 生物学功能富集分析与京都基因与基因组大百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG） 信号通路富集分析的方法，阐明hsa_circ_0043278 对Wnt 介导的细胞信号转导与PI3K-AKT 信号通路的影响， 为揭示hsa_circ_0043278 对结直肠癌发生发展的抑制作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 GEO数据库数据筛选基因表达数据库（Gene Expression Omnibus，GEO） 由美国国立生物 技 术 信 息 中 心 （National Center for Biotechnology Information，NCBI） 创建并维护［7］。以“ 结直肠癌” 为关键词进行搜索， 可获得GSE126094 芯片数据，该芯片包含10 例结直肠癌组织样本与10 例癌旁组织样本。首先，采用Perl语言将circRNA 的名称转换为标准的circRNA ID，同时采用R 语言读取GSE126094 芯片的数据，对circRNA 的 表 达 值 进 行 以2 为 底 数 的 对 数 变 换［8］，对相同的circRNA 有多个表达值数据，采用 “取平均值” 的方法合并； 使用R 语言对处理后的GSE126094 芯片数据进一步分析，得到结直肠癌组织样本与癌旁组织样本中差异表达的circRNA，界 定 条 件： |log2FC| ＞2 且P＜0.05。 并 绘 制GSE126094 数据中差异表达circRNA 热图和GSE126094 芯片数据中差异表达circRNA 火山图。

1.2候选circRNA的生物信息学分析采用circBase 数据库（http：//www.circbase.org） 确定差异表达circRNA 所在染色体的位置信息［9］；采用癌症特异性circRNA 数据库（Cancer-Specific circRNA Database， CSCD） 得 到 与 差 异 表 达circRNA 结 合 的miRNA［10］； 采 用Perl 语 言 检 索miRDB 数据库（http：//mirdb.org/）、miRTarBase数 据 库（http：//mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php） 与TargetScan 数 据 库（http：//www.targetscan.org/vert_72/），得到miRNA 的靶基因，用于进一步研究。采用R 语言对预测的靶基因进行GO 富集分析与KEGG 富集分析。GO 富集分析包括分子功能（molecular function，MF）、生物学过程（biological process， BP） 与细胞成分（cellular component， CC）［11］。 KEGG 富集分析包括系统信息、 基因组信息、 化学信息和健康信息［12］。以P＜0.05 判定为有统计学意义的富集。

1.3统计学分析采用RStudio 0.94.102 和ActivePerl v5.26 统计软件进行统计学分析。同一个circRNA 在结直肠癌组织与癌旁组织中表达水平的差异倍数以log2FC 表示，组间样本均数比较采用两独立样本t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1结直肠癌组织与癌旁组织中差异表达的circRNA 结直肠癌组织与癌旁组织均有10 个样本。差异表达circRNA 的认定条件：|log2FC|＞2 且P＜0.05，见图1 （插页八）。对GSE126094 中数据进行聚类分析， 结果表明存在差异表达的circRNAs （|log2FC|＞2 且P＜0.05）， 见 图2 （插页八）。通过对比结直肠癌组织样本与癌旁组织样本，共筛选出59 个差异表达circRNAs （|log2FC|＞2 且P＜0.05）。与癌旁组织样本比较，在结直肠癌组织样本中， 表达水平升高的circRNAs 有23 个（logFC＞2 且P＜0.05）， 表 达 水 平 下 降 的circRNAs 有36 个（logFC＜－2 且P＜0.05）。结直肠癌组织样本与癌旁组织样本表达差异倍数最大的是 hsa_circ_0043278 （logFC=－7.481 且P＜0.05），见表1。

2.2靶基因的预测结果对hsa_circ_0043278 进一步分析。采用circBase 数据库，检索得到hsa_circ_0043278 所在染色体位置信息。利用CSCD 数据库确定与hsa_circ_0043278 结合的miRNA，结果得到66 个与hsa_circ_0043278 结合的miRNAs。具体包括hsa-miR-1207-3p、 hsa-miR-1197 和hsa-miR-561-5p 等。 编 写Perl 程 序， 对miRDB 数 据 库、miRTarBase 数据库和TargetScan 数据库分别检索，得到这66 个miRNAs 的靶基因。 10 个代表性miRNAs 与其对应的靶基因见表2。

2.3靶基因GO富集分析结果在生物学功能方面，靶基因主要参与Wnt 介导的细胞信号转导、脱磷与对肽的反应等（P＜0.05）；在细胞成分方面，靶基因主要定位于染色质与核染色体等（P＜0.05）；在分子功能方面，靶基因主要参与近端启动子序列特异性DNA 结合和染色质结合与转录辅调节活性等（P＜0.05）。见图3 （封三）。

表1 结直肠癌组织和癌旁组织中部分circRNAs 表达水平差异倍数Tab.1 Difference multiples of some circRNAs expression levels in colorectal cancer tissue and adjacent cancer tissue

2.4靶基因KEGG富集分析结果利用R 语言对与hsa_circ_0043278 结合的miRNA 靶基因进行KEGG 富集分析。 共得到19 条KEGG 统计结果，靶基因主要与PI3K-AKT 信号通路、 MAPK 信号通路与调节干细胞多能性的信号通路等有关联（P＜0.05）。见图4 （封三）。

表2 部分与hsa_circ_0043278 结合的miRNAs 和miRNAs 的靶基因Tab.2 Part of miRNAs combined with hsa_circ_0043278 and target genes of miRNAs

3 讨 论

结直肠癌的发病率和死亡率普遍较高。尽管许多学者与科研机构对结直肠癌的研究非常深入，但仍有超过50% 的结直肠癌患者最终死于该疾病［13］。因此， 研究结直肠癌发生发展的机制非常必要。circRNA 作为非编码RNA 的一种，因其高稳定性和组织特异性已成为近年的研究热点［14］。circRNA 作为内源性RNA 可以与其他内源性RNA 竞争结合miRNA 从而影响靶基因的表达［15］。本研究从circRNA 的角度研究结直肠癌发生发展的机制。

芯片技术具有高通量与高效率的特点，与传统生物学方法相比优势明显［16］。本研究选取了GEO数据库中结直肠癌基因芯片表达谱数据， 包括10 例结直肠癌组织样本与10 例癌旁组织样本。通过比较2 组circRNAs 表达水平，共发现59 个有统计学意义的差异表达circRNAs，其中表达水平上升的circRNAs 有23 个，表达水平下降的circRNAs有36 个。与癌旁组织样本比较，在结直肠癌组织样本中hsa_circ_0043278 表达水平降低最明显，提示hsa_circ_0043278 可能在结直肠癌中具有一定特异性。

采用Perl 语言分别检索miRDB 数据库、miRTarBase 数据库与TargetScan 数据库，得到与hsa_circ_0043278 结 合 的miRNA 的 靶 基 因。 使 用R 语言对miRNA 的靶基因进行GO 富集分析与KEGG 富集分析。GO 富集分析包括3 个层面：BP、CC 和MF［17］。GO 富 集 分 析 结 果 表 明：靶 基 因 主要参与Wnt 介导的细胞信号转导、脱磷与对肽的反应等BP。已有研究［18-19］表明：Wnt 蛋白是调节分泌的生长因子，在胚胎发育过程中能调节干细胞的增殖和分化，细胞间Wnt 信号转导表达异常与癌症的发生有密切关系。脱磷是与hsa_circ_0043278 结合的miRNA 的靶基因主要参与的BP。 因此，hsa_circ_0043278 在结直肠癌组织样本中表达水平的异常降低可能会间接影响Wnt 介导的细胞信号转导与脱磷过程， 进而减弱了对结直肠癌的抑制作用。

KEGG 富集分析表明：与Hsa_circ_0043278 结合的miRNA 的靶基因富集的通路有PI3K-AKT 信号通路、MAPK 信号通路与调节干细胞多能性的信号通路等。PI3K-AKT 信号通路作为细胞中重要的信号转导通路之一，通过影响下游多种效应分子的活化状态，发挥着促进细胞增殖和抑制凋亡的作用［20］。 已 有 研 究［21］表 明： 组 成 性 活 化 的PI3KAKT 信号通路在广泛的人类肿瘤谱中失调，原因是AKT 被过度活化以及PI3K-AKT 通路的部分调控成分突变。因此，hsa_circ_0043278 在结直肠癌组织样本中表达水平的异常降低可能会间接影响其对PI3K-AKT 信号通路的调控作用，进而减弱了对结直肠癌的抑制作用。

本研究采用生物信息学方法确定了hsa_circ_0043278 在结直肠癌组织样本中表达水平异常降低（logFC=－7.481 且 P＜0.05）， 提 示 hsa_circ_0043278 的正常表达或提升其表达水平可能会抑制结直肠癌的发生发展。通过GO 富集分析与KEGG富集分析阐明了hsa_circ_0043278 的作用机制：其间接影响靶基因UTP18、 CLIP4 与STC2 等的功能，进而影响对Wnt 介导的细胞信号转导与PI3KAKT 信号通路的调控作用，最终降低了对结直肠癌的抑制作用。由于样本的局限性，本研究并未对结直肠癌的发生发展机制进行进一步探索。未来，本课题组将整合更多临床样本数据，并开展相应的生物实验，进一步揭示circRNA 对结直肠癌的作用机制。