小鼠下丘脑和海马组织神经干细胞的蛋白质组学分析

贾雪冰, 孙孟菲, 姚 莉, 刘 畅, 董 茵, 黄日祥, 柏 亮, 唐 晨, 申延琴, 崔 春

（1.江南大学无锡医学院实验中心，江苏 无锡 214122；2.江南大学无锡医学院神经退行和损伤研究室，江苏 无锡 214122）

神经干细胞（neural stem cells， NSCs） 具有自我更新和分化成神经元和胶质细胞的能力［1］。因NSCs 在维持脑内稳态和修复脑内损伤细胞的过程中发挥重要作用，使得NSCs 移植对于治疗中枢神经系统疾病具有良好前景。研究［2-3］表明：NSCs移植可以延缓衰老，治疗帕金森病、阿尔兹海默症和多发硬化等疾病。成年人NSCs 主要分布于大脑海马齿状回颗粒下层（subgranular zone，SGZ） 和侧 脑 室 室 下 区（subventricular zone， SVZ）［4］。 最近的研究［5］表明：下丘脑作为调节机体生理状态的中心，同样存在着NSCs。LEE 等［6］研究新出生和成年小鼠下丘脑区域发现：下丘脑存在可以持续增殖的细胞，并且增殖的细胞表达NSCs 的标记物Nestin 和Sox2，进一步研究发现这些新生细胞与机体新陈代谢有关联。研究［7-8］表明：大脑不同区域的神经发生具有特定分化倾向和功能特异性，海马SGZ 区NSCs 分化形成的神经元主要迁移至齿状回的颗粒细胞层成为齿状颗粒细胞，发挥学习、记忆和情绪调节等功能，而SVZ 区NSCs 分化形成的神经元则进行长距离的迁移，到嗅球区域形成颗粒细胞层的颗粒细胞和小球层的小球周细胞，发挥嗅觉和学习等功能［9-10］。SGZ 和SVZ 神经发生的特定分化倾向和功能特异性受到神经递质、生长因子和细胞内机制的影响［4］，但关于下丘脑神经发生的机制尚不明确。

目前干细胞移植治疗已经应用于临床治疗，并取得较好的治疗效果，研究［11］集中于海马干细胞的移植。关于下丘脑NSCs 移植治疗中枢神经系统疾病的研究鲜有报道，且下丘脑和海马作为NSCs的来源在蛋白表达方面是否存在差异尚未见研究报道，因此本文作者通过体外培养小鼠原代下丘脑和海马NSCs，采用蛋白质组学方法研究下丘脑和海马NSCs 在蛋白表达方面的差异，为下丘脑NSCs研究和NSCs 移植治疗神经系统疾病提供更多的思路和理论依据。

1 材料与方法

1.1实验动物、主要试剂和仪器12 只出生24 h 内的SPF 级雄性C57BL/6J 小鼠（苏州昭衍新药研究中心有限公司），动物生产许可证号：SCXK （苏） 2018-0006。Neurobasal-A 培养基、 磷 酸 盐 缓 冲 液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.4）、 TrypLE ™ Express 酶、 B-27 Supplement、 D-Hank’s液、 表 皮 生 长 因 子（epidermal growth factor，EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，b-FGF）、GlutaMAX 和青霉素-链霉素（美国Gibco 公司），Hepes 溶液、 多聚赖氨酸和层黏连蛋白（美国Sigma 公司），PBS 粉（北京索莱宝公司），多聚甲醛和葡萄糖（国产分析纯），FITC 羊抗小鼠二抗、Cy3 羊抗兔二抗和DAPI （上海碧云天公司），兔来源Sox2 抗体（美国Millipore 公司），鼠来源Nestin抗体（美国Abcam 公司）。正置显微镜（德国蔡司公司），体式显微镜（美国Motic 公司），串联质谱标签（tandem mass tag，TMT） 标记试剂盒、QExactive 质谱仪和高效液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LCMS/MS）分析系统（美国Thermo Fisher 公司），6 孔培养皿、60 mm 培养皿和100 mm 培养皿（美国Thermo Fisher 公司）， 35 mm 共聚焦皿（美国Nunc 公司）。

1.2原代NSCs的提取和培养

将出生24 h 内的乳鼠经75% 酒精消毒后，采用剪刀断头处死，在无菌环境中解剖出整脑组织，采用Solution A溶液（D-Hank’s 溶液含30 mmol·L－1葡萄糖、2 mmol·L－1Hepes 溶液和26 mmol·L－1的NaHCO3） 洗涤3 次，将整脑组织置于盛有预冷的Solution A 溶液的培养皿中，在体式显微镜下解剖出海马和下丘脑，将海马和下丘脑剪切成1 mm×1 mm×1 mm 的小块，采用TrypLE™Express 酶在37℃环境下消化组织25～30 min，PBS 终止消化，反复吹打消化组织，200 目细胞筛过滤，室温200 g离 心 5 min 弃 去 上 清， 采 用 IPM 培 养 基（Neurobasal-A 培 养 基 中 含2% B27， 20 μg·L－1EGF，10 μg·L－1b-FGF，0.24% GlutaMAX，1%双抗） 重悬细胞，细胞计数，以5×105mL－1的细胞密度铺于6 孔板中，在37℃、5% CO2的培养箱中培养，每隔1 d换去一半IPM培养基继续培养［12］。

1.3 NSCs的传代培养

分离培养的原代NSCs 培养5～7 d 后，在显微镜下可见大量悬浮的神经球，收集含有神经球的培养液，室温200 g 离心5 min 收集细胞，37℃环境下TrypLE™Express 酶消化细胞10 min，PBS 终止消化，将神经球吹打成单细胞悬液，室温200 g 离心5 min 收集细胞，采用IPM 培养基重悬细胞，经细胞计数后以1×105mL－1的细胞密度进行悬浮培养。

1.4免疫荧光法检测NSCs形成的神经球中Nestin和Sox2的表达

传代1 次的NSCs （P1 代） 形成神经球后，室温200 g 离心5 min 收集细胞，IPM 培养基重悬后，接种于预 先 包 被0.1 g·mL－1多 聚 赖 氨 酸 和1 g·mL－1层黏连蛋白包被的35 mm 共聚焦皿中，培养24 h 使神经球贴壁生长， 然后弃去培养液，PBS 洗涤3 次， 4% 多聚甲醛固定神经球20 min，PBS 洗涤3 次，每次2 min，0.l% Triton X-100 通透细胞10 min，PBS 洗涤3 次，每次2 min，5% 山羊血清在37℃封闭细胞30 min，弃去封闭液，加入小鼠抗Nestin （1∶100） 单克隆抗体和兔抗Sox2（1∶250） 单克隆抗体，4℃孵育过夜，弃去抗体，PBS 洗涤3 次，每次2 min，加入FITC 标记的羊抗鼠（1∶1 000） 和Cy3 标记的兔抗羊（1∶1 000）二抗37℃孵育细胞1 h，PBS 洗涤3 次，每次2 min，DAPI （1∶1 000） 室温 孵 育15 min ， PBS 洗 涤3 次， 每次2 min， 荧光显微镜下观察神经球中Nestin 和Sox2 表 达 信 号。

如果在A中∀q∈Q,∀B∈2AP都有|δ(q,B)|=1，那么A是一个完全的DFA.一个完全的DFA对于每个输入字σ∈(2AP)ω都存在一个唯一的运行与之对应.

待培养的传代2 次（P2 代） NSCs 形成神经球后，采用步骤 “1.3” 方法将P2 代神经球经酶消化成单细胞，采用IPM 培养基将单细胞培养在经多聚赖氨酸和层黏连蛋白包被的35 mm 共聚焦皿中，培养24 h 使细胞贴壁，然后依据步骤 “1.4” 采用免疫荧光法检测NSCs 中Nestin 和Sox2 的表达，同理检测传代3 次（P3 代） 和传代4 次（P4 代）NSCs 中Nestin 和Sox2 的表达。采用荧光显微镜采集NSCs 中Nestin 和Sox2 表 达 信 号 后， 计 算Sox2+/DPAI 和Nestin+/DPAI，以此代表Nestin 和Sox2 的阳性表达率。

1.5蛋白质组学法分析下丘脑和海马组织NSCs中蛋白表达

1.5.1 下丘脑和海马组织中NSCs 总蛋白的提取P4 代 海 马 的NSCs 设3 个 重 复 样， 分 别 为HI1、HI2 和HI3， P4 代 下 丘 脑 的NSCs 设3 个 重 复 样，分别为HY1、HY2 和HY3，收集培养的P4 代海马和下丘脑组织中NSCs，室温200 g 离心5 min 收集NSCs，加 入4℃预 冷 的PBS ， 重 悬 细 胞， 4℃、200 g 离心5 min，弃去上清，加入预冷的SDT 裂解液，超声裂解，25℃、14 000 g 离心40 min 收集沉淀，采用BCA 法进行蛋白质定量，将样品保存于－80℃。

1.5.2 TMT 标记实验 将 “1.5.1” 步骤提取的6 组NSCs 总蛋白采用FASP 法用胰蛋白酶酶解成肽段，经酶标仪于280 nm 处进行定量检测肽段吸光 度（A） 值， 每 组 分 别 取100 μg 肽 段， 采 用TMT 试剂进行标记。

1.5.3 高pH 反相肽段分级的检测 将每组标记后的肽段等量混合后通过高反相分级，具体方法：采用乙腈和0.1% 三氟乙酸进行柱平衡，将标记后的肽段样品上样，加入纯水后低速离心进行脱盐处理，采用梯度浓度的高pH 乙腈溶液对柱结合肽进行梯度洗脱， 洗脱的肽段样品真空干燥后采用12 μL 0.1% 三氟乙酸复溶冻干样品，测定肽段浓度后备用。

1.5.4 高效液相色谱- 串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry ，LC-MS/MS）分析 分级后的肽段样品采用纳升流速的HPLC 液相系统Easy nLC 进行分离。色谱柱以95% 的缓冲液（0.1% 甲酸水溶液） 平衡，样品由自动进样器上样到上样柱，以300 nL·min－1的流速经过分析柱分离。

样品经色谱分离后采用Q-Exactive 质谱仪进行质谱分析。检测方式为正离子母离子，扫描范围为300～1 800 m·z－1， 一 级 质 谱 分 辨 率 为70 000（200 m·z－1），最大离子注入时间为50 ms，动态排除时间为60 s。每次全扫描后采集20 个碎片图谱（MS2 scan）， MS2 激 活 类 型 为HCD ， 隔 离窗 口 为2 m·z－1， 二 级 质 谱 分 辨 率 为17 500（200 m·z－1），共进行15 个1 h 的LC-MS 分析，得出原始质谱数据。

1.5.5 蛋白质信息的汇总 采用Moscot 2.2 和Proteome Discoverer 1.4 统计软件对原始质谱数据进行数据库检索和定量分析， 按照过滤参数FDR ＜0.01 合并所有定量和定性蛋白质分析结果。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

1.5.6 生物信息学分析 对倍数变化＞1.2 倍且P＜0.05 的差异蛋白质进行生物信息学分析，包括基因本体（Gene Ontology，GO） 分析和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 分析。

1.6统计学分析

采用SPSS 22.0 统计软件对数据进行统计学分析。下丘脑和海马组织NSCs 中Nestin 和Sox2 阳性表达率、下丘脑和海马组织NSCs 中差异蛋白质的表达水平均符合正态分布，以x±s表示，组间比较采用t检验。 以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 NSCs的形态表现NSCs 在体外悬浮培养时，由于NSCs 增殖会形成神经球，从乳鼠下丘脑和海马中提取的细胞在体外悬浮培养5 d 后，在显微镜下可观察到球状的细胞团，即为NSCs 形成的神经球，显微镜下下丘脑组织中NSCs 和海马组织中NSCs 形成的神经球不透明， 具有较高的折光率，球的边缘有微丝，表明神经球具有较好的状态。见图1。

图1 小鼠来源的P0 代下丘脑和海马组织中NSCs 形态表现（Bar=200 μm）Fig.1 Morphology of mouse-derived P0 generation NSCs in hypothalamic and hippocampal tissues（Bar=200 μm）

2.2 NSCs的鉴定P2 代下丘脑神经球和海马神经球均呈现Nestin 表达阳性和Sox2 阳性，表明悬浮培养的神经球为NSCs。见图2 （插页二）。

2.3传代培养后下丘脑和海马组织中NSCs的纯化率P2～P4 代下丘脑和海马组织中NSCs 中Nestin 和Sox2 的阳性表达率随着代数的增加而增加，但下丘脑和海马组织NSCs 中Nestin 和Sox2 的表达阳性率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。当传代培养到P2 代，下丘脑组织NSCs 中Sox2 阳性 表 达 率 为（76.87±5.65） % （Sox2+/DPAI），海马组织NSCs 中Sox2 阳性表达率为（80.75±10.76） %； 下丘脑组织NSCs 中Nestin 阳性表达率 为（74.66±9.40） % （Nestin+/DPAI）， 海 马组织NSCs 中Nestin 阳性表达率为（80.72±12.71） %，见图3。当传代培养到P4 代，下丘脑组织NSCs 中Sox2 阳性表达率为（98.35±2.58） %， 海马组织NSCs 中Sox2 阳性表达率为（99.48±1.06） %；下丘脑组织NSCs 中Nestin 阳性表达率为（98.73±1.81） %， 海马组织NSCs中Nestin 阳性表达率为（99.48±1.06） %，见图4（插页三） 和图5，即传代培养可以提升下丘脑和海马组织NSCs 的纯化率，因此，本课题组选择具有较高纯度的P4 代下丘脑和海马组织的NSCs 用于后续研究，较高的NSCs 比例为蛋白质组学的分析提供了保证。

图3 下丘脑和海马组织P2～P4 代NSCs 中的Nesin 和Sox2阳性表达率Fig.3 Positive expression rates of Nesin and Sox2 in P2－P4 NSCs in hypothalamic and hippocampal tissues

2.4下丘脑和海马组织中NSCs质谱分析通过TMT 标记联合LC-MS/MS分析共匹配到131 016个质谱图，鉴定到42 456 个肽段，38 195 个特异性肽段和5 593 种蛋白，对鉴定到的蛋白质进行统计学分析显示：在下丘脑和海马组织NSCs 中最终得到10 种差异蛋白，其中相对于海马NSCs 上调的蛋白有6 种， 相对于海马NSCs 下调的蛋白有4 种。见表1。

图5 P4 代下丘脑和海马组织NSCs 中Nestin 和Sox2 阳性表达率Fig.5 Positive expression rates of Nestin and Sox2 of P4 generation NSCs in hypothalamic and hippocampal tissues

2.5差异蛋白质的GO和KEEG通路分析GO 功能富集分析结果表明：下丘脑组织NSCs 在某些生物 过 程（Biological processes， BP）、分 子 功 能（molecular functions， MF） 和细胞组分（cellular components，CC） 方面与海马组织NSCs 存在明显差异。其中，存在差异的BP 有响应铜离子、参与突触传递中多巴胺摄取的负调控、去甲肾上腺素摄取的负调控、谷胱甘肽过氧化物酶活性的正调控、谷胱甘肽过氧化物酶活性的调节和儿茶酚胺摄取的负调控等；存在差异的MF 包括铜离子结合、γ 谷酰 基 羧 化 酶 活 性、 β -1， 3- 半 乳 糖-0- 糖 基- 糖 蛋白β -1，3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶活性、花生四烯酸的结合、二十醛的结合和rRNA 甲基转移酶活性；存在差异的CC 有高尔基体膜、血小板颗粒膜和核内膜-内质网膜网络等方面， 见图6A （插页三）。KEGG 通路富集分析结果表明：与海马组织NSCs 中比较，下丘脑组织NSCs 在可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感性因子附着蛋白受体（SNARE）相关囊泡运动、肾素分泌、甘露糖型0-糖基生物合成、先天免疫缺陷、泛醌和其他萜烯类醌的生物合成、矿物质吸收和皮质醇合成与分泌通路上发生明显变化，见图6B （插页三）。

3 讨 论

NSCs 具有多向分化潜能、较低的免疫源性和较好的组织融合性，因此在针对神经退行性疾病如帕金森病及阿尔兹海默病等的治疗中，NSCs 移植治疗受到关注［13-14］。针对NSCs 的研究集中于海马的SGZ 和 侧 脑 室 的SVZ［4］， 最 近 的 研 究［6，15］显示：下丘脑同样存在NSCs。下丘脑是机体代谢、内分泌和心血管的调控中心，对于维持机体的稳态发挥重要作用［16］。 美国爱因斯坦医学院的研究者［17］ 发现：下丘脑组织NSCs 可以延缓衰老，提示下丘脑组织NSCs 在治疗衰老相关疾病中的潜在作用。下丘脑组织NSCs 和海马组织NSCs 虽同为脑内NSCs，但关于这2 种分布不同的NSCs 的功能差异尚无相关研究报道，因此本课题组通过蛋白质组学对下丘脑组织NSCs 和海马组织NSCs 进行蛋白表达的分析。

表1 下丘脑和海马组织NSCs 中蛋白变化情况Tab.1 Changes of proteins in NSCs in hypothalamic and hippocampal tissues

Nestin 在胚胎发育早期大量表达于神经上皮干细胞中，但在成熟的神经细胞中并不表达，因此常被用于鉴定NSCs［18］。研究［4］表明：Sox2 阳性细胞可以进行自我更新，单个Sox2 阳性细胞可以分化为神经元和胶质细胞。本研究将Nestin 和Sox2作为筛选NSCs 的标志物，并通过Nestin 和Sox2 阳性表达率对比体外培养下丘脑组织NSCs 和海马组织NSCs 的差异，结果表明对下丘脑组织NSCs 和海马组织NSCs 进行传代培养可以增加NSCs 的纯度，但下丘脑组织NSCs 和海马组织NSCs 在传代培养过程中的纯度比较差异并无统计学意义，说明下丘脑组织NSCs 和海马组织NSCs 在相同培养体系下表现出相似的增殖和分化特性。

本文作者共发现10 种蛋白出现了变化， 其中6 种蛋白在下丘脑组织NSCs 中表达上调，4 种蛋白在下丘脑NSCs 中表达下降，通过生物信息学GO 功能分析和KEGG 通路注释发现这些差异蛋白主要在突触传递及代谢等方面发挥作用。进一步对蛋白的研究显示：许多蛋白在维持细胞功能发面发挥重要作用， 如视网膜母细胞瘤样蛋白2（retinoblastoma-like protein 2，P130），其具有抑制E2F 转录激活因子的功能，在调节神经元死亡和存活中起关键作用［19］。主要表达于内质网的突触融合蛋白18 （Syntaxin-18），参与内质网和高尔基体之间的转运［20］。Syntaxin-18 基因敲除可以导致内质网膜结构的变化，造成平滑内质网膜和粗糙内质网膜的分离［21］，表明Syntaxin-18 在细胞生成的蛋白转运中不可或缺，但关于这些蛋白具体的作用机制尚需进一步研究。

综上所述，本研究体外培养小鼠原代下丘脑和海马组织NSCs，通过蛋白质组学鉴定了不同来源NSCs 在蛋白质表达方面的差异，这些差异蛋白对于研究不同类型NSCs 的特性、下丘脑和海马组织NSCs 移植治疗中枢神经系统疾病具有重要意义。