胃癌患者血清中胃癌相关细胞因子检测及其在胃癌诊断中的应用价值

孙瑞营, 李 洋, 赵 旭, 曲林琳, 续 薇, 张蕴莉

（1.锦州医科大学附属第一医院检验科，辽宁 锦州 121000；2.吉林大学第一医院检验科，吉林 长春 130021；3.吉林大学第一医院肝胆胰内科，吉林 长春 130021）

胃癌尤其是胃腺癌，是中国乃至全世界最常见的恶性肿瘤之一。调查［1］显示：我国每年新发胃癌病例约40 万例，死亡率总体呈上升趋势。胃癌早期无明显症状，或与胃炎和胃溃疡等胃慢性疾病症状相似。因此早期诊断和治疗是降低患者死亡率及改善患者预后的重要手段。目前，临床上常用的胃癌诊断方法是基于肿瘤标志物的检测，主要包括癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖链抗 原19-9 （carbohydrate antigen 19-9， CA19-9）和 糖 链 抗 原72-4 （carbohydrate antigen 72-4，CA72-4） 这3 种。 研 究［2］表 明： 肿 瘤 标 志 物CEA、 CA19-9 和CA72-4 的水平受疾病的进展和临床分期影响较大，单独检测可能存在对胃癌诊断灵敏度和特异度不高的情况，故肿瘤标志物联合检测对提高胃癌诊断的准确度具有重要作用。研究［3］表明：多种细胞因子与胃癌的发生发展有着密切关系。微小RNA 在肿瘤中起多种关键作用，本课题组前期研究［4］已证实：miR-10b 作为上游因子抑制Tiam1/Rac1 介导的胃癌细胞的发生和转移，推测miR-10b 和细胞因子表达与胃癌的发生有关联。但目前关于细胞因子对胃癌诊断价值的研究较少，ELISA 等常用检测方法大多以单一因子检测为主，现有研究中所检测的细胞因子种类较少，也不尽相同，同时未与临床上常用的胃癌诊断方式进行比较。本研究采用Luminex 高通量液相芯片技术检测胃癌患者血清中巨噬细胞炎性蛋白 3α（macrophage inflammatory protein-3α， MIP-3α/CCL20）、白细胞介素2 （interleukin-2，IL-2）、白细胞介素4 （interleukin-4， IL-4）、 白细胞介素5（interleukin-5， IL-5）、 白细胞介素6 （interleukin-6，IL-6）、白细胞介素10 （interleukin-10，IL-10）、白细胞介素17A （interleukin-17A， IL-17A）、 肿瘤 坏 死 因 子α （tumor necrosis factor-α， TNF-α）、干扰素γ （interferon-γ，IFN-γ）、单核细胞趋化因子（monocyte chemoattractant protein -4，CCL13）、干扰素诱导T 细胞α 趋化因子（interferon-induced T cell alpha chemokine，CXCL11）、B 淋巴细胞趋化因子（B-lymphocyte chemoattractant，CXCL13）、骨 形 成 蛋 白4 （bone morphogenetic protein 4，BMP4）、骨形成蛋白7 （bone morphogenetic protein 7， BMP7）、 肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、粒细胞集落刺激因子（granulocytemacrophage colony stimulating factor， GM-CSF）、血小板衍生因子BB （platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB） 的表达水平，从miR-10b 与细胞因子的相关性以及细胞因子与胃癌的关系两个方面探讨相关细胞因子在胃癌诊断中的应用价值。

1 材料与方法

1.1研究对象基于病例对照研究设计， 以2016 年12 月—2017 年12 月在吉林大学第一医院确诊为胃腺癌的患者血清标本34 例作为胃癌组，以同期来自体检中心的健康者血清标本80 例作为对照组，所有患者均知情同意，本研究获锦州医科大学附属第一医院伦理委员会批准。收集所有研究对象的临床信息，包括年龄、性别、实验室常规检查和术后病理组织学检测等信息。样本采集要求：清晨空腹肘静脉真空负压采血， 采血量为3.5 mL，血 液 采 集 后2 h 内 进 行3 700 r·min－1室 温 离心5 min，取上层血清置于－80℃低温冰箱中储存待进一步分析。胃癌组纳入标准：①明确诊断为胃腺癌的患者；②术前未进行放疗、化疗和生物免疫治疗，术前无其他肿瘤病史者；③胃癌病理TNM分期明确者。排除标准：①资料不完整者；②并发其他肿瘤或脏器疾病者；③近期有输血史者。对照组纳入标准：①标本来源为吉林大学第一医院体检中心的健康者；②血、尿、便、生化和肿瘤标志物等实验室检测结果正常者；③超声和CT等影像结果正常者。

1.2主要试剂和仪器17 种细胞因子检测试剂盒购于美国R&D 公司，miR-10b 检测试剂盒购于北京全式金生物公司， CEA、 CA19-9 和CA72-4 检测试剂盒购于美国Roche 公司。 液相芯片分析仪（型号X-200 Luminex， 美国R&D 公司）， 实时荧光 定 量PCR （quantitative real-time fluorescence polymerase chain reaction，qRT-PCR） 仪（型号C obas z480，美国Roche 公司），电化学发光全自动免疫分析系统（型号Cobas e601，瑞士罗氏公司）。

1.3检测方法对17 种细胞因子的检测采用Luminex 方法，检测结果表示为ng·L－1；实验采用同样方法测得不同浓度的蛋白标准品作为质量控制，同时样本采用双孔数据重复，以保证检验结果的准确性。①准备好所需试剂及样品， 在96 孔板中每孔加入200 μL 清洗液，室温震荡10 min 后倒掉，加入25 μL 标准品、质控品于对应孔，25 μL缓冲液于背景孔和样品孔，25 μL 血清于背景孔、标准品孔和质控品孔，加入25 μL 预混磁珠微球于每孔，封口，室温震荡2 h；②将微孔板放置于磁力架上至少1 min，确保微球被吸附住，采用清洗液每孔200 μL 洗涤2 次；③每孔加 入25 μL 生物素标记的检测抗体复合物，同样室温下1 h，摇床速度设置为800 r·min－1，微孔板封口；④不清洗，每孔加入25 μL 链霉亲和素标记的PE，同样室温下0.5 h，摇床速度设置为800 r·min－1，微孔板封口；⑤将微孔板放置于磁力架上至少1 min，确保微球被吸附住，采用清洗液每孔200 μL 清洗2 次；⑥采用150 μL 清洗液重悬微球，孵育5 min，摇床速度设置为800 r·min－1，上机检测。

miR-10b mRNA 水平检测采用qRT-PCR 方法，测定结果以CT 值表示；①血清miRNA 的提取，首先在冰盒上缓慢溶解取出的冻存血清，吸取200 μL 血 清 至1 只 新 的1.5 mL RNAse-free 离 心 管中，随即加入5 mol·μ L－1cel-miR-39-3p 标 准 品5 μL，每个血清样品加入标准品后立即涡旋，随后采 用EasyPure® miRNA 试 剂 盒 提 取miR-10b ；②miRNA 加尾反应及合成为cDNA，配置反应体系，包 含9.2 μL miRNA 模 板；1 μL TransScript®miRNA RT Enzyme Mix； 10 μL 2×TS miRNA Reaction Mix，总体积为20 μL。在以上反应体系瞬时离心后，在37℃下反应60 min、85℃条件下反应5 s； ③qRT-PCR 反 应， 将 得 到 的cDNA 采 用RNAse-free Water 稀释5倍。配置qRT-PCR 体系，包 括6 μL5 倍 稀 释 的cDNA 、 2 μ L 上 游 引 物（2 μmol·L－1）； 2 μL 通 用 引 物（2 μmol·L－1） 和10 μL 2×TransStart®Tip Green qPCR SuperMix，总体积为20 μL。将配置好的八连管放入qRT-PCR仪中， 在94℃下反应30 s 后， 在94 ℃、 30 s 及60 ℃、5 s 的温度体系下完成40 个循环。反应结束后检测反应特异度。3 种肿瘤标志物的检测采用电化学发光法，准备好所需试剂及样品放入标本位进行检测， CA199 和CA724 测定结果单位为U·mL－1，CEA 测定结果单位为μg·L－1。

1.4统计学分析采用SAS 9.4 统计软件进行统计学分析。胃癌组患者血清中IL-2、IL-4、IL-5、IL-17A、GM-CSF、BMP-4 和PDGF-BB 水平符合正态分布，以x±s表示；胃癌组患者血清中其他因子以及对照组研究对象血清中17 种细胞因子水平不满足正态分布，以M （P25，P75） 表示，进行非参数统计Wilcoxon 秩和检验。2 组研究对象性别构成比比较采用χ2检验。采用Spearman 等级相关系数评估胃癌组患者血清中细胞因子与miR-10b 水平的相关性。采用单因素Logistic 回归模型分析胃癌组患者胃癌患病风险与细胞因子之间的关联性并计算曲线下面积（area under curve， AUC），评估细胞因子预测肿瘤的价值。 采用约登系数（Youden index，YI） 确定细胞因子最优临床截断值。计算细胞因子和临床常用肿瘤标志物对胃癌诊断的准确度，评估细胞因子在胃癌诊断中的应用价值：灵敏度=真阳性人数/（真阳性人数+假阴性人数） ×100%；特异度=真阴性人数/（真阴性人数+假阳性人数） ×100%；阳性似然比=灵敏度/（1―特异度）；阴性似然比= （1―灵敏度） /特异度； 阳性预测值= （灵敏度× 患病率） / ［灵敏度×患病率+ （1―患病率）（1―特异度）］；阴性预测值=特异度× （1― 患病率） / ［特异度×（1―患病率） + （1―灵敏度） ×患病率］。

2 结 果

2.1对照组和胃癌组研究对象血清中17种细胞因子水平对照组和胃癌组研究对象的平均年龄分别为（58.00±10.66） 岁和（61.00±9.11） 岁， 对照组和胃癌组研究对象中女性所占的比例分别为46.25% 和32.35%，2 组研究对象年龄和性别构成比比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组比 较， 胃 癌 组 患 者 血 清 中IL-2 、 IL-4 、 IL-6 、IL-17A、 TNF- α、 CCL13、 CCL20、 BMP-4 和HGF 水平明显升高（P＜0.05）， 而IL-5、 IL-10、IFN- γ、 GM-CSF、 CXCL11、 CXCL13、 BMP-7和PDGF-BB 水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。对照组和胃癌组研究对象血清中17 种细胞因子（IL-2、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-10、 IL-17A、TNF- α、 IFN- γ、 CCL13、 CXCL11、 CXCL13、CCL20、 BMP4、 BMP7、 HGF、 GM-CSF、PDGF-BB） 水平见表1。

表1 对照组和胃癌组研究对象血清中17 种细胞因子水平Tab.1 Levels of 17 kinds of cytokines in serum of subjects in control group and gastric cancer group

2.2血清细胞因子与胃癌患病风险关系的Logistic回归分析Logistic回归分析结果显示：血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-17A、TNF-α、CXCL11、CCL13、CCL20、BMP4、BMP7 和HGF 水平升高均与胃癌患病风险有关联；与对照组比较，CCL20 水平较高的胃癌组患者患胃癌风险增加了65% （OR：1.65； 95%CI： 1.28～2.12；P＜0.01）。未发现其他细胞因子与胃癌患病风险间有关联性。

表2 血清细胞因子水平与胃癌患病风险的关系Tab.2 Correlations between serum levels of cytokines and risk of gastric cancer

2.3血清细胞因子的ROC曲线ROC 曲线分析结果显示：细胞因子CCL20的AUC高达0.92（图1），明显高于肿瘤标志物CEA （AUC=0.613）、CA19-9 （AUC=0.576） 、 CA72-4 （AUC=0.482） 单独及联合诊断（AUC=0.64）（图2），提示该蛋白可能是极为有效的胃癌诊断的标志物。多因子联合诊断分析结果显示： 与单独使用CCL20 进行诊断比较，TNF-α、BMP-4 和CCL20这3 个细胞因子的联合诊断对胃癌的预测能力并未明显提高（AUC=0.93），见图3。

采用YI 方法选取灵敏度和特异度总和最高时所对应的血清CCL20 水平为最优临床截断值，分析结果显示： 当CCL20 水 平 为6.71 μg·L-1时，YI 值最大。当以该浓度作为筛查标准时，其诊断实验的特异度为76.5%、灵敏度为91.3%、阳性预测值为78.8%、阴性预测值90.1%、阳性似然比为8.74、 阴性似然比为0.26、 诊断准确度为86.84%。 与临床常用的肿瘤标志物CEA 、CA19-9、CA72-4 单独或联合诊断的效能比较，采用CCL20 进行诊断的灵敏度明显升高，而特异度也保持在较高水平。见表3。

2.4胃癌组患者血清细胞因子与miR-10b水平的相关性胃癌组患者血清中17 种细胞因子与miR-10b 水平的相关关系较弱，其中TNF-α 与miR-10b水 平 的 相 关 系 数（r）=0.335 （P=0.075）。见表4。

3 讨 论

本研究通过对胃癌组胃癌患者血清样本和对照组健康人血清样本中17 种细胞因子进行检测分析发现：与对照组比较，胃癌组患者血清中CCL20、IL-2、 IL-4、 IL-6、 IL-17A、 TNF- α、 CCL13、BMP-4 和HGF 水平明显升高，其中CCL20 水平较高的胃癌组患者患胃癌风险增加了65%。

图1 与胃癌发生有关联的细胞因子的ROC 曲线Fig.1 ROC curves of cytokines correlated with occurrence of gastric cancer

图2 肿瘤标志物单独和联合诊断胃癌的ROC 曲线Fig.2 ROC curves of single and combination diagnosis of tumor markers in gastric cancer

图3 多因子单独和联合诊断胃癌的ROC 曲线Fig.3 ROC curves of single and combination diagnosis of cytokines in gastric cancer

表3 CCL20 和常见肿瘤标志物对胃癌的诊断价值Tab.3 Diagnostic values of CCL20 and common tumor markers in gastric cancer

表4 胃癌组患者血清细胞因子与miR-10b 水平的相关性Tab.4 Correlations between levels of cytokines and miR-10b in patients in gastric cancer group

趋化因子是吸引淋巴细胞浸润，产生并维持慢性炎症的重要细胞因子，与趋化因子受体结合后可以使细胞发生趋化运动，广泛参与细胞生长及凋亡等多种功能，从而与疾病的发生发展密切相关。多项研究［5-7］表明：胃癌组患者血清细胞因子CCL20和CCL13 水平明显高于对照组，与本研究结论相符，提示CCL20 和CCL13 水平与胃癌患病风险有关联。IL-2 是重要的抗肿瘤功能标志物，以往的研究［8］显示胃癌患者血清IL-2 水平在病情严重时降低趋势，与本研究结论有所不同，可能原因一是由于血清中IL-2 水平或许无法真实反映组织中IL-2水平，二是由于本研究中有56% 的患者是Ⅰ/Ⅱ期胃癌，而早期胃癌患者中IL-2 水平升高是否与肿瘤初期机体应激反应有关联尚不清楚，因此关于IL-2 与胃癌患病风险的关联仍需进一步研究。IL-4是Th2 产生的抗炎性细胞因子，尽管IL-4 有抑制肿瘤的功效，但有研究［9］显示：IL-4 水平过度升高会通过下调Th1 型因子使Th 细胞平衡向Th2 方向漂移，而体内Th1 和Th2 的失衡会消减细胞介导的免疫反应，从而促进肿瘤的发生发展，这一机制可能是胃癌组患者血清IL-4 水平明显高于对照组的原因。多项研究［10-11］显示：胃癌患者血清IL-17过度表达，与本研究结论相符，这可能与IL-17 可通过促进血管的生成和肿瘤细胞的迁徙、从而促进胃部肿瘤的生长有关联。 关于TNF-α、 BMP4 和HGF 与胃癌患病风险关联的研究［12］结论多与本文研 究 结 果 一 致， TNF- α 可 能 通 过 活 化TNF- α/TNFR1 信号通路，从而诱导Noxo1 和Gnal4 参与细胞分化和肿瘤生长， 促进肿瘤的发展。 有研究［13］ 显示： 在对淋巴结转移患者进行治疗后，TNF-α 水平有明显降低。BMP4 和HGF 在胃癌组织 中 高 表 达［14-15］，马 松 林 等［16］发 现：BMP4 可 能通过上调Snail 的表达促进胃癌细胞的迁移和侵袭。HGF 可通过PI3K/AKT 信号通路促进胃癌细胞的侵袭［17］。

本研究结果表明：与临床常用的肿瘤标志物CEA、 CA19-9 和CA72-4 联合诊断结果（AUC=0.64） 比较，采用CCL20 对胃癌患者进行诊断的AUC 较 高（AUC=0.92）， 诊 断 准 确 度 可 达86.84%。当以6.71 μg·L－1作为临床截断值时，诊断的灵敏度为76.47%、特异度为91.25%、阳性预测值为78.79%、阴性预测值为90.12%、阳性似然比为8.74、阴性似然比为0.26、诊断准确度为86.84%，高于3种肿瘤标志物联合诊断的准确度（78.95%，） 提示细胞因子CCL20 可用作胃癌诊断的特异标志蛋白，有望成为新的胃部肿瘤标志物。研 究［18-19］证 实：CCL20 在 胃 癌 组 织 中 的 表 达水平明显升高。针对胃癌的发生机制，有研究［18］显 示： CTKL 介 导 的CCL20/CCR6 经 由Akt 途 径诱导胃癌上皮细胞发生间质变， 且通过抑制CCL20/CCR6-CRKL-Erk1/2-EMT 途 径， 有 望 靶向拮抗胃癌的发展。探讨幽门螺杆菌与CCL20 表达关系的研究［20］显示：胃癌和癌旁组织中CCL20水平较高，探讨其相关性认为二者可能共同参与胃癌的发生发展。胃癌的发生发展是复杂的多因素过程，CCL20 在胃癌发生发展过程中的作用机制还需进一步探索，以往关于CCL20 与胃癌关系的研究多数集中在组织水平，其作为血清标志物的可能性尚未见报道。血清检测比组织样品测定更简单经济，但由于本研究中研究对象仅包含胃癌患者和健康对照者，未包含患有胃部炎症的个体，且样本量较小，关于其是否能作为胃癌诊断标志物应用于临床仍需在较大范围及较大样本中进一步研究，后续将纳入胃部炎症样本，多层次多角度针对CCL20水平升高的机制进行探讨，为新的肿瘤标志物应用于临床提供依据。

本研究结果显示：TNF-α 与miR-10b 的相关性最强， 但结果并不显著。 研究［21］显示： 组织中miR-10b 水平与多种肿瘤的恶变和转移有关，例如乳腺癌、肝癌、胰腺癌、食道癌和神经胶质瘤等。早 期 研 究［4］证 实：Tiam1/Rac1 信 号 通 路 异 常 活 化促进胃癌细胞的极性改变、炎性浸润、侵袭和转移， 在组织中， miR-10b 作为上游因子通过抑制Tiam1 下调Tiam1/Rac1 信号通路的活化，从而抑制Tiam1/Rac1 介导的肿瘤细胞的发生和转移［22］。在血清中，miR-10b 水平与肿瘤大小、淋巴结转移情况相关，随着肿瘤直径增大以及淋巴结的转移，血清中的miR-10b 水平升高［23］。由此推测在影响胃癌发生发展的过程中，血清中miR-10b 水平可能与细胞因子存在相关性，从而出现炎性反应。有关胃癌相关细胞因子与miR-10b 关系的研究目前国内外未见报道。本研究也未发现胃癌组患者血清中细胞因子与miR-10b 水平间存在明显关联，这可能与本次研究样本量较少，同时采用Spearman 秩相关分析使得统计效能有所降低有关。因此，关于细胞因子与miR-10b 的关联仍需在较大样本中进一步研究。

本研究结果显示：胃癌组患者血清CCL20 水平明显高于对照组。 ROC 曲线分析显示： 当将6.71 μg·L－1作为血清CCL20 水平的临界点时，其对胃癌诊断的灵敏度明显优于常用肿瘤标志物CEA、CA19-9 和CA72-4，且特异度也保持在良好水平，提示血清CCL20 水平可能在胃癌诊断中具有重要的应用价值，有望成为新的胃癌标志物。