栀子苷对实验性帕金森病大鼠睡眠障碍的调节作用及其机制

骆晓峰, 李 瑶, 胡 江, 张宸豪

（1.吉林医药学院基础医学院生理学教研室, 吉林 吉林132013；2.吉林医药学院检验学院病原技术教研室，吉林 吉林132013；3.吉林医药学院附属医院口腔教研室,吉林 吉林132013）

帕金森病（Parkinson’s disease， PD） 是一种常见于中老年人的神经系统退行性疾病，以黑质多巴胺能神经元进行性缺失并伴有Lewy 小体为主要病理特征［1-2］。随病情发展除运动功能障碍外，患者几乎不可避免地出现睡眠障碍、抑郁、焦虑和痴呆等一系列非运动症状［3-5］，其中以睡眠障碍发生率最高，严重影响患者的生活质量。因此深入了解PD 的发病机制，寻找有效的神经保护剂仍是目前治疗PD 的主要策略［6-7］。栀子苷是中药栀子干燥成熟果实提取的环烯醚萜苷化合物， 是栀子发挥药效的主要成分。最新研究［8-10］表明：栀子苷可以提高原代培养海马神经元的抗氧化效应、抵抗细胞凋亡、调节脑小胶质细胞活化、改善小鼠记忆能力障碍。但外源补充栀子苷是否能够改善睡眠障碍尚未见报道。本实验在构建PD 动物模型的基础上，进一步研究栀子苷改善PD 患者睡眠障碍的可能机制，为PD 的临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验动物、主要试剂和仪器清洁级Wistar 大鼠，体质量170～200 g，雌雄各半，购自吉林大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK （吉）2016-0003 ； 6- 羟 基 多 巴 （ 6-hydroxydopa，6-OHDA） 和阿卟吗啡均购自美国Sigma 公司，抗坏血酸购自上海时代生物技术有限公司，栀子苷购自长春德尔塔生物技术有限公司。脑立体定位仪购自深圳瑞沃德公司，脑电信号采集分析系统购自成都泰盟公司，高效液相色谱仪购自日本岛津公司，振动切片机购自德国莱卡公司，CR22G 高速离心机购自日本日立公司。

1.2大鼠PD模型的制备和动物分组随机选取70 只Wistar 大鼠，以10 %水合氯醛腹腔注射麻醉，脑立体定位仪上颅脑平位固定。剥离脑膜，暴露前囟，根据大鼠立体定位图谱，确定前脑内侧束坐标（前囟前4.0 mm， 正 中 线 右1.7 mm， 硬 膜 下8 mm），微量注射器注射4 μL 6-OHDA （浓度为4 g·L－1，溶剂为含0.02 %抗坏血酸的生理盐水溶液）， 注 射 速 度 为0.5 μL·min－1， 并 留 针10 min，以1 mm·min－1的速度缓慢拔针。大鼠清醒后连续3 d 腹腔注射青霉素。造模4 周后，腹腔注射阿卟吗啡（1.0 mg·kg－1） 诱发旋转实验，记录30 min大鼠旋转圈数，隔日1 次，共3 次，3 次诱导旋转圈数均大于210 r·30 min－1的大鼠被视为PD 模型大鼠。本实验造模成功率为55 %，模型构建成功的30 只大鼠分为模型组、低剂量栀子苷组和高剂量栀子苷组，每组10 只，取10 只未造模的正常大鼠设为正常对照组。低和高剂量栀子苷组大鼠每日通过灌胃给予栀子苷溶液（50 和100 mg·kg－1，以PBS 水溶液配制），共4 周，正常对照组和模型组大鼠相同时间给予等量生理盐水灌胃。

1.3各组大鼠睡眠时间检测将大鼠固定于脑立体定位仪上。将3 个脑电电极植入颅骨内，将2 个肌电电极分别插在大鼠左、右侧颈部深肌层，术后腹腔注射青霉素，连续3 d，恢复1 周后开始记录大 鼠 的 脑 电 和 肌 电［11-13］。 脑 电 图（electroencephalogram， EEG） 和 肌 电 图（electromyography， EMG） 信 号 经 过 放 大 滤 过（EEG： 0.3～100 Hz； EMG： 10～100 Hz）， 再以256 Hz 扫描速度进行自动记录，各组均记录72 h 时大鼠的EEG 和EMG，并自动以10 s 为一个时间段分析、鉴别，对各组大鼠的睡眠觉醒周期进行分析，记录各组大鼠总睡眠时间、觉醒时间、快波睡眠时间和慢波睡眠时间。

1.4高效液相色谱法（HPLC）分析各组大鼠纹状体中多巴胺水平将各组大鼠采用10 %水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速断头取脑置于0 ℃～4 ℃的人工脑脊液中，在脑片中仔细分离出纹状体组织样品， 将1 mg 样 品 加 入0.04 mol·L 高 氯 酸100 μL，超声粉碎30 s，使细胞破碎， 在4 ℃离心机内以14 000 r·min－1的 速 度 离 心30 min， 留 取 上 清 液，每组纹状体样品准确吸取20 μL 进行HPLC，记录出峰时间与峰面积，采用Breeze 2 软件计算单位体积样品中多巴胺水平。

1.5统计学分析数据采用SPSS 15.0 统计软件进行统计学分析。各组大鼠总睡眠时间、觉醒时间、慢波睡眠时间、快波睡眠时间和纹状体中多巴胺水平以±s表示，各组数据进行正态分布及总体方差齐性检测，对符合正态分布且总体方差齐的指标采用单因素方差分析，不符合正态分布且总体方差不齐的指标进行非参数Kruskal-WallisH检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组大鼠总睡眠时间与正常对照组比较，模型组大鼠总睡眠时间明显缩短（P＜0.01）；与模型组比较，低和高剂量栀子苷组大鼠总睡眠时间明显延长（P＜0.05）； 与低剂量栀子苷组比较，高剂量栀子苷组大鼠总睡眠时间明显延长（P＜0.05）。见图1。

图1 各组大鼠总睡眠时间Fig.1 Total sleep time of rats in various groups

2.2各组大鼠觉醒时间与正常对照组比较，模型组大鼠觉醒时间明显延长（P＜0.01）；与模型组比较，低和高剂量栀子苷组大鼠觉醒时间明显缩短（P＜0.05）；与低剂量组比较，高剂量栀子苷组大鼠觉醒时间明显缩短（P＜0.05）。见图2。

2.3各组大鼠慢波睡眠时间与正常对照组比较，模型组大鼠慢波睡眠时间明显缩短（P＜0.01）；与模型组比较，低和高剂量栀子苷组大鼠慢波睡眠时间明显延长（P＜0.05）；与低剂量栀子苷组比较，高剂量栀子苷组大鼠慢波睡眠时间明显延长（P＜0.05）。见图3。

图2 各组大鼠觉醒时间Fig.2 Awaken time of rats in various groups

图3 各组大鼠慢波睡眠时间Fig.3 Slow wave sleep time of rats in various groups

2.4各组大鼠快波睡眠时间与正常对照组比较， 模型组大鼠快波睡眠时间明显减少（P＜0.01）。与模型组比较，低和高剂量栀子苷组大鼠快波睡眠时间明显延长（P＜0.05）；与低剂量栀子苷组比较，高剂量栀子苷组大鼠快波睡眠时间延长明显（P＜0.05）。见图4。

图4 各组大鼠快波睡眠时间Fig.4 Fast wave sleep time of rats in various groups

2.5各组大鼠纹状体中多巴胺水平与正常对照组比较，模型组大鼠纹状体多巴胺水平明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，低和高剂量栀子苷组大鼠纹状体多巴胺水平明显升高（P＜0.05）；与低剂量栀子苷组比较，高剂量栀子苷组大鼠纹状体多巴胺水平升高（P＜0.05）。见图5。

图5 各组大鼠纹状体中多巴胺水平Fig.5 Dopamine levels in striatum of rats in various groups

3 讨 论

PD 是一种常见于中老年人群的的神经系统退行性疾病，具有典型的运动症状，如静止性震颤、肌肉僵直、运动迟缓和步态异常，但除特征性的运动症状外，PD 患者还会出现非运动症状，如睡眠障碍、记忆障碍、情感障碍和自主神经功能紊乱等，且非运动症状可能早于运动症状的出现，其中以睡眠障碍发生率最高。严重影响患者生活质量。PD 患者睡眠功能障碍的发病机制尚未完全明确，可能是多基因多因素协同发挥作用，其发病机制无论是氧化应激、线粒体功能障碍还是蛋白质错误折叠、聚集、炎症及神经递质的兴奋毒性等，均可导致多巴胺能神经元异常凋亡［14-17］。在PD 与凋亡的研究中，除了传统的死亡受体途径和经典的线粒体途径外，已有证据表明内质网应激介导的凋亡参与了PD 的发病过程。

目前PD 的治疗主要以西药 “替代疗法为主”，虽然能够改善临床症状，但长期大量应用会出现运动及精神障碍等不良反应，无法缓解多巴胺能神经元进行性变性引发的病理损伤。而中药治疗具有疗效持久和不良反应少等优点，已成为近年来防治PD 新药的研究热点［18］。单味中药、中药复方和 针灸等治疗效果均得到临床肯定。 尹帅领等［19］发现：肉苁蓉多糖通过激活Wnt/β-catenin 信号通路对6-HODA 致PD 大鼠具有神经保护作用；霍绮雯等［20］发现定振丸对PD 大鼠神经递质及黑质多巴胺能神经元氧化应激具有改善作用。中药栀子具有清热泻火和凉血解毒等功效。 有研究［21-25］表明：栀子苷可以提高损伤神经细胞活力，减轻神经细胞凋亡，对PD 小鼠模型具有调节DA 代谢和神经保护作用，改善创伤所致小鼠记忆功能障碍。但对睡眠障碍影响未见相关报道。本实验采用脑内立体注射6-OHDA 构建PD 动物模型，因其可选择性损伤黑质-纹状体儿茶酚氨神经末梢，最终导致多巴胺能神经元发生退行性病变，多巴胺合成释放减少。本研究结果显示：与正常对照大鼠比较，PD 大鼠表现出总睡眠时间减少、觉醒时间延长、慢波睡眠减少、快波睡眠抑制和睡眠效率降低等不同程度的睡眠障碍，纹状体中多巴胺水平明显降低；各剂量栀子苷组大鼠总睡眠时间、慢波睡眠时间较模型组明显延长，而觉醒时间较模型组明显缩短，说明一定浓度的栀子苷可有效缓解帕金森模型大鼠的睡眠障碍，增加睡眠总时间，减少觉醒时间；各剂量栀子苷组大鼠纹状体中多巴胺水平明显高于模型组，因此推测栀子苷具有改善PD 模型大鼠睡眠障碍的作用机制很可能是栀子苷通过抑制兴奋性氨基酸类神经递质的释放，对中脑多巴胺能神经元产生了神经保护性作用，进而提高纹状体中多巴胺水平，这一研究成果为神经退行疾病的治疗提供了有益的思路，尤其是对PD 的治疗。但PD 发病机制受多种因素影响［26-27］，所以下一步将从细胞分子水平探讨栀子苷神经保护作用机制，并在后续实验中加以证实。