新型冠状病毒肺炎患者中性粒细胞/淋巴细胞比值及细胞活化水平的研究

孙晓东 朱波 柴森茂 陶艳丽 鲁晶晶 徐红霞 许倩倩 付攀 桑明

湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院，武当特色中药研究湖北省重点实验室（湖北十堰442000）

新型冠状病毒肺炎（COVID⁃19）对人类来说是一种全新的疾病。研究发现“炎症风暴”可能是重症和危重症患者进展为急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），以及发生脓毒性休克、代谢性酸中毒、凝血功能异常、多器官衰竭等危重症状的根本原因之一［1］。因此，尽快揭示严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS⁃CoV⁃2）（国际病毒分类委员会命名）的致病特性，及其诱发“炎症风暴”的免疫机制，是应对SARS⁃CoV⁃2感染的根本策略。

炎性反应参与机体多种生理病理过程，中性粒细胞/淋巴细胞比值（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）、血小板/淋巴细胞比值（platelet to lym⁃phocyte ratio，PLR）、淋巴细胞/单核细胞比值（lym⁃phocyte to monocyte ratio，LMR）可做为炎性反应的指标。在肿瘤疾病、心脑血管疾病、感染性疾病中上述比值综合体现患者体内炎性反应和免疫状态，在疾病的诊断、治疗和预后评估中有重要的参考价值［2-7］。既往研究显示NLR与病毒感染患者的预后密切相关［8］，最近一项针对61例COVID⁃19患者的研究报告显示，NLR是COVID⁃19重症患者的早期识别因素，也是患者重症化的重要指标［9］。CD15又称粒细胞相关性抗原，是成熟的中性粒细胞表面标记抗原，CD15在中性粒细胞活化和非活化状态下的表达强度不一，当机体出现感染症状时CD15的表达强度可以发生变化［10］，而HLA⁃DR是T细胞被活化的表面抗原之一［11-12］。本研究纳入20例COVID⁃19患者，采用流式细胞术检测中性粒细胞中CD15的表达，T淋巴细胞HLA⁃DR的表达率，分析CD15+中性粒细胞和活化的T淋巴细胞与SARS⁃CoV⁃2感染患者病情进展的相关性，探讨NLR、CD15+中性粒细胞频数、HLA⁃DR+T淋巴细胞的频数在预测COVID⁃19患者的炎症水平中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料2020年2-3月湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院救治的SARS⁃coV⁃2感染患者20例，其中男15例，女5例，年龄范围为28～76岁。所有患者均于收治当日通过咽拭子采样后送检SARS⁃CoV⁃2核酸，并行胸部CT检查，经2次SARS⁃CoV⁃2核酸检测均为阳性，10例在入院后病情进展迅速，最终转入ICU救治，纳入重度组，男8例，女2例，年龄范围为32～76岁；余10例病例，病情平稳，纳入普通组，男7例，女3例，年龄范围为28～68岁。全部入组患者诊断符合《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第三版）》［13］。本研究已通过襄阳市第一人民医院医学伦理委员会审核批准（2020GCP005），符合2013年修订的《赫尔辛基宣言》的要求。

1.2 研究方法

1.2.1 资料收集收集患者入院当天（基线）、1周后、出院时血常规中总白细胞数、淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞、血小板计数，血生化检测中肌酸激酶（creatine kinase，CK）、乳酸脱氢酶（1actate dehydrogenase，LDH）、C反应蛋白（C⁃reac⁃tive pmtein，CRP）等临床指标。计算NLR、ΔNLR1（入院后1周NLR）、ΔNLR2（出院），比较两组间的差异。

1.2.2 流式细胞术检测采用多色抗人单克隆抗体（mAbs）联合试剂PerCP⁃cy5.5⁃CD45/PE⁃CD3/FITC⁃CD15/APC⁃HLA⁃DR和匹配的同型对照，在入院当天、1周后、出院当天测定外周血免疫细胞亚群。将EDTA抗凝外周血100 μL进行抗体染色，用红细胞裂解液除去红细胞，流式细胞术检测外周血淋巴细胞、中性粒细胞占比，CD15+中性粒细胞、HLA⁃DR+T细胞百分比。所有试剂均购自BD公司（BD，Franklin Lakes，USA）。所有标本均采用BD FACS Aria Ⅱ流式细胞仪进行检测，并使用BD流式细胞仪Diva软件进行分析。

1.3 统计学方法连续变量用均数±标准差表示，正态分布的计量资料应用两独立样本t检验，非正态分布的计数资料采用Mann⁃whitney U检验；计数资料以例（%）表示，用χ2检验或确切概率法进行比较。应用SPSS 24.0统计软件进行数据的统计学分析，P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者基线资料比较两组患者的基本资料显示，在年龄、性别、并发症等方面，两组之间差异没有统计学差异。重度组患者有60%出现肌痛症，与普通组相比差异有统计学意义。见表1。

2.2 两组患者治疗期间中性粒细胞百分比、淋巴细胞百分比及NLR 均发生动态变化从三次检测结果分析，两组患者入院后中性粒细胞百分比均存在先升高后降低的动态变化，淋巴细胞百分比则是先降低后升高的动态变化，入院时和入院一周后检测结果在两组间差异均有统计学意义，出院时两组间差异没有统计学意义，见图1。入院时，重度组与普通组NLR比较差异有统计学意义；治疗1周后，两组间NLR差异有统计学意义；出院时，两组间NLR差异有统计学意义。两组间ΔNLR差异无统计学意义。见表2。重度组中性粒细胞百分比、淋巴细胞百分比及NLR在治疗的第1周时达到高峰，这与患者转入ICU治疗的时间基本吻合，并在出院时恢复到与轻度患者相当的水平。

表1 两组患者入院时基本信息Tab.1 Basic information of two groups at the time of admission 例（%）

表2 两组患者治疗期间NLR 及ΔNLR 比较Tab.2 Comparison of NLR and ΔNLR during treatment between two groups M（P25，P75）

2.3 两组患者治疗期间CD15+中性粒细胞与HLADR+T 细胞频数发生动态变化流式检测圈门策略见图2，CD45标记白细胞后，圈出淋巴细胞、单核细胞、粒细胞，粒细胞检测FITC⁃CD15+的百分比。两组患者治疗1周时CD15+粒细胞的百分比有明显差异，见图2B；CD15+粒细胞的百分比在治疗期间有动态变化，两组间有明显差异（图3A）。淋巴细胞检测T细胞标记CD3，然后检测T细胞HLA⁃DR+的百分比，两组间差异有统计学意义，见图2C、3B。流式检测发现CD15+中性粒细胞在两组间差异有统计学意义，重度组CD15+中性粒细胞百分比有动态变化，入院1周时达到高峰，随治疗好转比例下降；普通组CD15+中性粒细胞百分比没有明显变化，见图3A。活化的T细胞水平在两组都有明显动态变化，入院1周时升到高峰，随治疗好转比例下降，重度组HLA⁃DR+T细胞变化波动更大，见图3B。

3 讨论

SARS⁃CoV⁃2是目前已知的除SARS⁃CoV（引发重症急性呼吸综合征）［14］和MERS⁃CoV（引发中东呼吸综合征）［15］外又一种高致病性冠状病毒。由于免疫细胞对全身器官都有作用，患者死因也不仅是呼吸衰竭，许多死亡病例是死于心脏、肾脏、肝脏衰竭，而这些脏器受损的主要原因就是病毒诱发的细胞因子风暴［1，16］。SARS和MERS病理性损伤的严重程度与肺部中性粒细胞的广泛浸润和外周血中中性粒细胞数量的增加有关［17-20］。因此，中性粒细胞计数增加的幅度和淋巴细胞计数下降的幅度也可能提示COVID⁃19患者炎症反应的强度，也表明了病毒感染对免疫系统的损害程度的扩大。因此，NLR可能是反映COVID⁃19患者炎症和免疫反应不平衡程度的一个指标。

图1 中性粒细胞和淋巴细胞百分比动态变化Fig.1 Dynamic changes in the percentage of neutrophils and lymphocytes

图2 流式检测外周血CD15+中性粒细胞和HLA⁃DR+T 细胞的频数Fig.2 CD15+neutrophils and HLA⁃DR+T cells of peripheral blood were detected by FCM

图3 流式检测外周血CD15+中性粒细胞和HLA⁃DR+T 细胞的动态变化Fig.3 Flow cytometric detection of CD15+neutrophils and HLA⁃DR+T cells in peripheral blood

作为人体血液循环中最丰富的白细胞，中性粒细胞在先天免疫中对抵御入侵的病原体发挥重要的吞噬杀伤作用，但其过度浸润和激活可导致组织结构的破坏和更严重的炎症。因此，中性粒细胞在炎症反应过程中扮演着重要而双重的角色。CD15是人中性粒细胞的表面标志之一，在正常情况下，保持静止状态的中性粒细胞大约以1 000 mm/s的速度在血液中高速循环流动。当机体发生病原体入侵时，中性粒细胞通过识别和结合炎症部位的血管内皮细胞表面表达的选择素和黏附分子，被招募到炎症部位，进而通过吞噬、脱颗粒以及形成中性粒细胞诱捕网（neutrophil extra⁃cellular traps，NET）的方式对病原体进行清除［21］。最新研究显示，人类嗜中性粒细胞中NET的形成与肺炎患者呼吸窘迫的发生率和严重程度相关［22］。中性粒细胞对炎症部位进行吞噬杀伤的同时，分泌各种趋化因子，招募其他免疫细胞进入感染部位，进一步触发炎症信号［10］。T细胞介导的特异性细胞免疫在机体清除和杀伤病毒的过程中发挥至关重要的作用［23］。T细胞活化时，在其细胞表面的分子标志物中，HLA⁃DR分子与CD38分子参与激活信号的转导［11］，通过诱导特定的细胞因子生成来促进T细胞的活化。因此，中性粒细胞CD15的表达比例和T细胞HLA⁃DR的表达比例可以反应机体炎症反应的状态。

本研究对20例COVID⁃19患者进行回顾性研究，发现两组患者NLR均随病情进展动态变化，治疗1周时，NLR显著升高，治愈出院时，显著降低；重度患者比普通组患者变化更加显著；HLA⁃DR+T细胞和CD15+中性粒细胞比例在重度组中明显高于普通组。中性粒细胞活化后释放趋化因子可激活T细胞，活化的T细胞释放细胞因子IFN⁃γ、IL⁃2、IL⁃4、IL⁃10、TNF⁃α等，中性粒细胞被过度活化和增殖，形成细胞炎症信号级联反应，这可能是炎性风暴形成的机制之一。

LIU等［24］筛选了影响COVID⁃19患者预后的因素，发现CD8+T细胞显著减少，而且中性粒细胞与CD8+ T细胞的比值（N8R）在ROC曲线分析中表现更好，AUC值高于NLR，在预测COVID⁃19患者病情严重化方面，N8R可能是比NLR更有力的因素。本研究结果发现NLR存在动态变化，但是ΔNLR在两组间差异无统计学意义，可能与样本量少、动态监测时间点少有关。

综上所述，外周血中性粒细胞和淋巴细胞的数量，尤其是CD15+中性粒细胞和HLA⁃DR+T细胞的数量与疾病的严重程度是动态相关的。这与WANG等［25］描述COVID⁃19患者淋巴细胞亚群和细胞因子动态变化的研究是一致的。NLR是早期鉴测COVID⁃19重症病例的有力预后因素。这项工作有助于阐释SARS⁃CoV⁃2感染的免疫逃逸机制。