应用全自动毛细血管电泳技术对杭州地区地中海贫血的筛查

徐冰 史秀羽 陈宇

[摘要] 目的 了解杭州地区地中海贫血的检出情况，探讨产检中筛查地中海贫血的意义，评价平均红细胞体积（MCV）、平均血红蛋白量（MCH）及血红蛋白电泳对地中海贫血进行产前筛查的价值。 方法 以2019年2月～2020年3月在我院检查的3968例育龄期妇女为研究对象，进行血常规、血红蛋白电泳及β-地贫基因检测。 结果 筛查3968例育龄期妇女，疑似α-地中海贫血或缺铁性贫血共有366例（9.22%），其中妊娠中晚期孕妇有255例;疑似β-地中海贫血共有19例（0.48%），其中有4例进行β-地贫基因检测，均被确诊为β-地中海贫血，分别为βIVS-II-654/βN突变1例，βCD17/βN突变2例，βCD41/42/βN 1例。 结论 MCV、MCH及血红蛋白电泳可以对地中海贫血进行产前筛查，整体操作较为简便。加强地中海贫血筛查及检测，可以降低出生缺陷，对优生优育具有重要意义。

[关键词] 毛细血管电泳仪;地中海贫血;基因诊断;产前筛查

[中图分类号] R556.61          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2020）28-0143-04

Application of automatic capillary electrophoresis in screening for thalassemia in Hangzhou area

XU Bing   SHI Xiuyu   CHEN Yu

Department of Laboratory， Hangzhou Obstetrics and Gynecology Hospital， Hangzhou   310008， China

[Abstract] Objective To understand the detection situation of thalassemia in Hangzhou area，to explore the significance of screening for thalassemia during obstetric testing， and to evaluate the value of mean red blood cell volume（MCV）， mean hemoglobin volume（MCH） and hemoglobin electrophoresis for prenatal screening of thalassemia. Methods A total of 3968 women of childbearing age examined in our hospital from February 2019 to March 2020 were taken as the research subjects. They underwent blood routine， hemoglobin electrophoresis and β-thalassaemia genes detection. Results A total of 3968 cases of women of childbearing age were screened. A total of 366 cases（9.22%） were suspected of α-thalassemia or iron deficiency anemia， including 255 pregnant women in mid-to-late pregnancy. Nineteen cases（0.48%） were suspected of β-thalassemia，of which 4 cases were tested for β-thalassemia gene. All were diagnosed with β-thalassemia， with 1 case of βIVS-II-654/βN mutation， 2 cases of βCD17/βN mutation， 1 case of βCD41/42/βN， respectively. Conclusion The MCV， MCH and hemoglobin electrophoresis can be used for prenatal screening of thalassemia， and the overall operation is relatively simple. Strengthening the screening and detection of thalassemia can reduce birth defects and is of great significance for eugenics.

[Key words] Capillary electrophoresis instrument; Thalassemia; Genetic diagnosis; Prenatal screening

地中海貧血（Thalassemia）又称珠蛋白生成障碍性贫血或海洋性贫血，是一组由于基因缺陷导致生成血红蛋白的珠蛋白肽链（αβγδ）的结构异常或合成异常所致的遗传性溶血性贫血疾病，属常染色体隐性遗传病[1]。根据合成障碍的肽链不同可分为α型、β型、δβ型和δ型4种，其中以α-地中海贫血和β-地中海贫血（简称α-地贫和β-地贫）最为常见。世界上有 4.83%的人口携带珠蛋白变异基因[2]，主要集中在热带和亚热带地区，好发于地中海沿岸、美国黑人人群、北非、东南亚和印度次大陆等地区。我国则集中在南方地区，以广东、广西、海南和香港最多见[3]，北方则少见。其中2012年广东育龄人群的地中海贫血基因携带率约为16.83%[4]，广西人群中地中海贫血基因携带率为12.22%～23.02%[5-7]，是我国南方重点防治的单基因遗传性疾病。目前尚无根治方法，最根本的措施是进行产前常规筛查和诊断，在育龄人群中进行地贫常规筛查，对筛查阳性者进行基因检测后再进行遗传咨询。本研究对2019年2月～2020年3月在我院进行常规检查的3968例育龄期妇女为研究对象，应用血常规和血红蛋白电泳技术对地中海贫血进行筛查，然后再应用基因检测技术进行验证，以了解杭州地区地中海贫血的检出情况，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2019年2月～2020年3月在我院进行常规检查的3968例育龄期妇女，年龄15～49岁。

1.2 方法

1.2.1 样本采集及处理  研究对象无需空腹，采集静脉血4 mL分两次每次2 mL注入一次性含乙二胺四乙酸二钾（EDTK-K2）抗凝剂的真空采血管中，一管用于血常规检测，另一管用于血红蛋白电泳检测。血常规当天检测，用于血红蛋白电泳检测的样本可置于2～8℃冰箱保存，7 d内检测。

1.2.2 血常规相关指标检测  应用迈瑞BC-6900全自动血细胞分析仪（BC-6900血球仪）及配套试剂进行血常规五分类检测，得出MCV及MCH值。BC-6900血球仪采用鞘流阻抗法、激光散射法、结合荧光染色的流式细胞技术进行细胞分类、计数;采用比色法进行血红蛋白测定。

1.2.3 血红蛋白电泳检测  Capillarys 2 Flex Piercing是全自動电脑控制通过电泳和数据处理进行蛋白质分离的、多项目的毛细管电泳系统。本实验应用法国Sebia公司生产的Capillarys 2全自动毛细血管电泳仪进行血红蛋白电泳检测，使用前核对仪器性能及准备配套试剂盒，按照说明书进行操作，标本无需洗涤和溶血，直接将抗凝标本放入仪器试管架中，一个检测架可同时检测8个样本，可同时检测多批样本，将试管架推入电泳仪进行检测，查看结果。

1.2.4地贫基因诊断  对于筛查表型阳性标本应用DNA快速提取试剂盒按操作说明提取其DNA。采用PCR结合反向点杂交 RDB（PCR-RDB）方法，检测中国人中常见的17种β-地贫基因突变：CD41/42、CD71/72、CD27/28、CD14/15、CD26、CD31、CD17、CD34、Int、IVS-1-1、IVS-1-5、-32、-30、-29、-28、CAP、IVS-2-654。试剂盒购于深圳亚能生物公司，按试剂盒说明书进行操作、质量控制及结果判断。取 DNA 2 μL加入反应管中，PCR 条件：50℃ 15 min，95℃ 10 min，然后94℃ 60 s→55℃ 30 s→72℃ 30 s经35个循环，最后72℃延伸5 min。将扩增产物与结合有中国人较常见的17种β-地贫基因突变寡核苷酸探针的膜条进行反向点杂交，鉴定β-地贫基因突变的类型。

1.3 诊断标准

血常规MCV≤80 fL，MCH≤27 pg[8-9]，HbA2<2.2提示可能是α-地中海贫血或是缺铁性贫血;如果HbA2>3.2 提示可能是β-地中海贫血[10]。

2 结果

筛查3968例育龄期妇女结果显示，HbA2<2.2共有366例，检出率为9.22%，其中有255例为妊娠中晚期孕妇;HbA2>3.2 共有27例，检出率为0.68%，其中血常规结果符合MCV≤80 fL，MCH≤27 pg有19例（0.48%），其中有4例进行β-地贫基因检测，均被确诊为β-地中海贫血，分别为βIVS-Ⅱ-654/βN突变1例，βCD17/βN突变2例，βCD41/42/βN 1例。

3 讨论

地中海贫血是一种家族遗传性溶血性贫血病，由于基因缺陷，血红蛋白中一种或多种珠蛋白链合成缺如或不足，使红细胞体积较小或寿命缩短，导致疾病的发生，是世界上最常见和发病率最高的遗传性溶血性贫血，也是危害最严重的血红蛋白病之一[11]。其中β-地中海贫血的分子基础主要为少数核苷酸的缺失、插入或置换，目前全世界发现的β-地贫基因突变已超过200种，中国人β-地贫基因突变类型34种，但不同地区的人群有各自的常见基因突变类型[12]。通常，如果父母双方只要其中一人是地贫轻度患者，或是携带地贫基因，那么就会将该基因遗传到下一代，如果父母双方均携带该基因，那么患儿就会拥有2个致病基因。轻型地贫患儿在刚出生时，不会出现明显的异常，与其他婴儿无异，但是随着时间的推移，患儿就会出现浑身无力、贫血、全身浮肿等现象。而重型地贫患儿出生后不久就会夭折，有的甚至是胎死腹中。

地中海贫血常见的两个类型为α-地中海贫血与β-地中海贫血。α-地中海贫血在临床上可分为4种类型：静止型、标准型、Hb H病和Hb Bart's胎儿水肿综合征，其分子机制分别有1、2、3、4个α-基因缺陷（缺失或突变）。静止型无任何特殊症状，与正常婴儿无异，红细胞无异常，脐血可能会与正常指标有所差距，但是一般在3个月后便可恢复正常;轻型与静止型相同，无特殊症状，血中红细胞形态轻度异常，脐血也很难达到正常指标，但多在半年后便可自行消失，对患儿基本没有伤害;Hb H病患者有轻至中度贫血，出现肝脾肿大、黄疸等症状;Hb Bart's水肿胎常于妊娠晚期（23～38周）胎死腹中或早产后数小时死亡，这类胎儿较为明显的体形特征是腹部和胸部出现积水伴有重度贫血。另外，一些非缺失型Hb H病和非缺失型 α-地贫纯合子患儿会出现严重贫血，有的甚至需要输血治疗。

在β-地中海贫血中，轻型β-地中海贫血无任何特殊症状，脾脏大小正常，如果日后没有特殊病情出现，寿命不受影响，可一直正常生活到老年;中间型β-地中海贫血症状较轻型重，较重型轻，常在幼儿时期出现贫血症状，骨骼有轻微改变，脾脏略大，多于幼童期出现中度贫血症状;重型β-地中海贫血患儿出生时无殊，出生数日后逐渐出现异常，如肝脾肿大进行性加重、发育不良、黄疸伴严重贫血等症状，随着年龄的增长，患儿会出现特殊表现，如头大、眼距增宽、马鞍鼻、前额突出、两颊突出，其典型的表现是臀状头、长骨可骨折等，骨骼改变是骨髓造血功能亢进、骨髓腔变宽、皮质变薄所致，少数患者在肋骨及脊椎之间发生胸腔肿块，亦可见胆石症、下肢溃疡，除了外观上的异常，患儿身体的器官也同样会出现不适，如肺炎、气管炎等，最为严重的是引发心脏疾病，极易造成心脏衰竭，如果不配合相关治疗，患儿往往活不过5岁。由于轻型β-地中海贫血可无临床症状，所以极易造成漏诊和误诊。

目前国内外用于明确诊断的是聚合酶链反应（PCR）技术结合其他分子生物学手段检测β-地中海贫血基因[13]，但分子生物学技术要求条件高，方法繁琐，尚不能广泛应用于各级医院特别是基层医院。因此，常用简单、方便的血液检测方法进行地中海贫血的筛查，包括平均红细胞参数（MCV、MCH、MCHC）、红细胞脆性、血红蛋白电泳等[14]，其中血红蛋白电泳在地中海贫血的筛查中起到非常重要的作用。正常人体内有3种血红蛋白即HbA、HbA2、HbF，应用血红蛋白电泳目的是检出和确认各种正常和异常的血红蛋白，因各种Hb的等电点不同，所带电荷量不同，可将其分成不同的区带。全自动血红蛋白电泳能够定量检测HbA、HbA2、HbF的含量，根据Hb各组份含量计算。其中HbA2可用于地中海贫血筛查[15]，主要用于地中海贫血的分型，HbA2降低是由于α链合成缺失或减少，而HbA2增高，则说明β链合成出现问题，一般为β-地中海贫血[16]。HbA2的分离可通过高压液相离子交换层析法（IE-HPLC）或电泳法，应用Capillarys 2全自动毛细血管电泳仪检测时，不但可完全分离部分血红蛋白变异体，相对于IE-HPLC操作简单，自动化程度高，检测时间短，无需切换模式和更换试剂[17]。同时，有文献也证实Capillarys 2全自动毛细血管电泳仪检测的HbA2适用于β-地中海贫血的筛查，其敏感性和特异性更高[18]。

MCV是地中海贫血筛查中较为重要的指标，MCV及MCH假阳性主要以小细胞低色素贫血常见，且致病原因多，常见的因缺血引起的贫血中既有表现为MCH、MCV降低的类型，初筛判断为地贫患者中有相当一部分患者属于缺铁性贫血，本研究对象为3968例育龄期妇女，HbA2<2.2共有366例，检出率为9.22%，其中有255例为妊娠中晚期孕妇，经过流行病学调查，中国约20%的孕妇有生理性的缺铁性贫血发生，多数在补充铁剂后，就会得到纠正，产后也会逐渐恢复。所以，初筛HbA2<2.2时需经过血清铁蛋白检测排除，以降低地中海贫血假阳性率[19]，排除缺铁性贫血后，再进行基因检测诊断地中海贫血。HbA2>3.2共有27例，检出率为0.68%，其中血常规结果符合MCV≤80 fL，MCH≤27 pg的有19例（0.48%），其中有4例进行β-地贫基因检测，均被确诊为β-地中海贫血，分别为βIVS-Ⅱ-654/βN突变1例，βCD17/βN突变2例，βCD41/42/βN 1例。由此可以得出结论，相对于广西和广东省等地贫高发地区，杭州属于低发区。但随着我国经济水平的提高，交通的发达与便利，人口流动性不断增加，低发病区的发病率也会逐渐提高，所以，重视并建立有效的地中海贫血产前筛查与诊断模式尤为重要。

地中海贫血有多种筛查方法，血液学指标MCV、MCH对地贫筛查敏感性较高，可自动化、大批量操作，适合用于大规模健康人群的地贫筛查。血红蛋白电泳分析是诊断和分离异常血红蛋白的有效方法，对于初筛阳性者通过血红蛋白电泳区分出不同的地中海贫血类型，需要对其进行一对一的遗传咨询和优生指导，特别是对高危夫妇通过进一步的基因诊断和产前诊断。目前PCR技术仍是临床上地贫基因突变确认的最佳手段[20]，基因诊断技术能确诊地中海贫血缺失或突变[21]，有效提高地中海贫血的检出率，对优生优育、干预重症地中海贫血患儿出生有着重要作用[22]，可以有效预防重症地中海贫血患儿的出生。随着科技的发展，各种检测手段层出不穷，但总的目标是更方便、更快捷、更便宜，为提高地中海贫血诊断的准确性，减少误诊和漏诊，将筛查法和基因诊断法有机结合起来，并为产前诊断、产前预防、选择性流产等方面做出应有的贡献。

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（收稿日期：2020-03-31）