microRNA-34a在上皮-间充质转化中的作用

李占峰，肖 楠，姚建新，姚紫阳，姚志峰

microRNAs(miRNAs)是一类高度保守的单链非编码RNA，长度只有20～24个核苷酸。它们可以与mRNAs的3＇非翻译区域(untranslated regions, UTR)结合，抑制信使RNA(mRNA)翻译，或诱导mRNA降解或脱腺苷化，从而在转录后沉默基因表达[1]。miRNAs通过调控靶基因表达，参与多种信号传导途径，调控包括细胞增殖、转移、凋亡、衰老、分化、自噬和免疫反应等诸多生物学过程[2]，并与肿瘤等疾病的发生、发展密切相关[3]。miRNAs可能发挥肿瘤抑制因子或癌基因作用[4]。miRNA 34a(miR-34a)作为miR-34家族成员[5]，是首个被证实受p53直接调控的miRNA[6]。miR-34a在大肠癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌和骨肉瘤等组织中均有异常表达。许多研究表明，miR-34a作为一种生物学标志物，可用于肿瘤的诊断和预后判断[7-8]。原发肿瘤细胞可通过上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)获得迁移和侵袭能力，导致肿瘤转移[9-10]。miR-34a可通过EMT而影响肿瘤转移。近年来研究表明，mRNA、环状RNA(circRNA)、伪基因转录本和长链非编码RNA(LncRNA)等通过microRNA反应元件调节相互表达，从而竞争性结合miRNAs，即竞争性内源RNA(ceRNA)机制[11]。本文就miR-34a在肿瘤中的作用及其相关EMT机制，尤其是ceRNA机制在调节miR-34a及EMT中的作用做一综述。

1 miR-34a调控肿瘤细胞EMT导致肿瘤转移

大多数肿瘤细胞通过EMT获得转移和侵袭能力，导致肿瘤转移[12]。通过EMT过程，上皮细胞失去了形态和黏附能力，并获得了间质表型[13]。EMT的特点是使细胞失去极性，一些上皮标志物如钙黏附蛋白E、细胞角蛋白和α-连环蛋白表达减少，而一些间质标志物如神经型钙黏附蛋白、波形蛋白、纤维连接蛋白和基质金属蛋白酶表达增加[9,12-13]。

EMT产生具有侵袭性的细胞，使它们能进入血液，并经全身转移到其他器官。EMT是肿瘤进化过程中的重要过程，为肿瘤细胞提供适合生存的微环境。适当的细胞环境、细胞因子和细胞外信号可诱导EMT[14]。miR-34a对肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭有负性调控作用[15-16]。研究表明，使用多西环素诱导pri-miR-34a表达可致人结肠癌细胞SW480中波形蛋白下调和E-cadherin上调，提示miR-34a可负性调节EMT以抑制癌细胞增殖和侵袭[17]。

2 miR-34a调控EMT的作用机制

2.1miR-34a与EMT诱导转录因子(EMT-transcription factors, EMT-TFs)的3′-UTR结合调控EMT 一项使用多西环素诱导pri-miR-34a表达的研究发现，除EMT标记的表达变化外，还观察到EMT-TFs的变化，提示其对肿瘤相关EMT的激活是必不可少的[18]。miRNAs可与EMT-TFs结合，从而形成双负反馈环来干扰肿瘤相关的EMT[19]。与miR-34a相关的EMT-TFs有如下3种：①锌指转录因子SNAIL家族，包括SNAIL1、SNAIL2和SNAIL3；②ZEB转录因子，包括ZEB1和ZEB2；③基本螺旋-环状-螺旋转录因子家族，包括TWIST1、TWIST2和E12/E47[20-21]。miR-34a直接与EMT-TFs的3′-UTR结合，调节肿瘤相关的EMT。SNAIL 3′-UTR含有与miR-34匹配的保守序列[17,22]。SNAIL家族是唯一与所有3个miR-34家族成员(miR-34a/b/c)具有匹配序列的EMT-TFs，进一步研究证实SNAIL是miR-34家族的直接靶标[22]。除了SNAIL家族外，其他EMT-TFs(如ZEB1、ZEB2和TWIST1)的3′-UTR也存在与miR-34a匹配的保守序列以及干性因子BMI1、CD44、CD133和c-MYC，这些干性因子通过与miR-34a直接结合而表达降低[5]。

2.2miR-34a通过p53调控EMT p53失活或突变是因抑制SNAIL1的表达和活性，进而促进肿瘤细胞发生EMT[22]。p53激活则通过诱导miR-34a/b/c下调SNAIL表达，抑制miR-34a/b/c则致SNAIL上调，细胞呈EMT标记的改变和相关特征，从而增强细胞迁移和侵袭能力。miR-34a异位表达诱导EMT，下调SNAIL表达[17]。故p53、SNAIL1和miR-34形成反馈回路以控制肿瘤细胞产生EMT[22]。

2.3miR-34a通过靶向TP53和MDM4诱导p53激活 除了p53调节miR-34a的表达外，miR-34a还通过直接靶向TP53和MDM4来诱导p53激活。TP53和MDM4是p53反式激活抑制剂[23]。miR-34a通过靶向多种p53抑制剂来激活p53的功能，从而从表观遗传学角度提高p53的转录活性[24]。miR-34a对p53网络的正负效应的复杂性表明，miR-34a不是简单地促进p53反应，而是可能促进p53对遗传毒性应激反应的稳定性[23]。与p53野生型细胞相比，p53突变的卵巢癌细胞miR-34a表达下调[25]。当细胞用p53化学激活剂Nutlin-3a处理时，miR-34a的表达显著增加[26]。这表明miR-34a是p53的下游靶点。更重要的是，p53通过增强miR-34a的表达来调节SNAIL的表达和活性，从而减少EMT[22]。总之，miR-34a、p53和EMT形成了一个复杂的网络，以影响彼此的功能[16]。

2.4miR-34a经Wnt、TGF-β1/Smad3/4、Notch信号传导途径调控EMT miR-34a不仅可经调控EMT-TFs和抑癌基因p53，还可经Wnt[27]、TGF-β1/Smad3和Notch1等信号传导途径调控EMT[28]。

2.4.1Wnt信号传导通路：研究表明，miR-34a可通过调节正常乳腺和乳腺癌细胞中的多途径相关基因负性调控Wnt的转录活性[29]。淋巴增强因子1(LEF1)是Wnt信号传导通路中的重要转录因子，参与细胞增殖和侵袭的调控。miR-34a经调节LEF1表达来调控前列腺癌细胞EMT，并与前列腺癌细胞迁移和侵袭呈负相关。同样，miR-34a可能经特异性抑制LEF1调控前列腺癌的EMT过程[30]。miR-34a经抑制膀胱癌TCF1/LEF1轴而促进人膀胱癌阿霉素耐药株的化疗敏感性[31]。HOX转录反义RNA(HOX transcript antiense RNA，HOTAIR)是一种高度丰富和保守的反义RNA，参与包括胃癌对顺铂的耐药性在内的许多重要生物学过程，敲除HOTAIR经上调miR-34a抑制顺铂耐药，提示HOTAIR/miR-34a轴对胃癌细胞的作用涉及PI3K/Akt和Wnt/β-catenin信号传导通路[32]。

2.4.2Notch信号传导通路：除了EMT-TFs外，miR-34a还可以通过与关键靶基因结合来调节EMT。例如，miR-34a可以与结肠癌细胞和宫颈癌细胞中Notch1和Jagged1的3＇-UTR结合，从而抑制细胞迁移能力，并抑制波形蛋白和纤维连接蛋白的表达，促进E-cadherin的表达[28]。miR-34a通过调节与耐药性相关的靶基因JAG1和Notch1来减弱对紫杉醇的耐药性。NFIX环状RNA通过Notch信号传导通路特异性结合miR-34a-5p来调控Notch1的表达，进而促进胶质瘤的进展[33]。

2.4.3转化生长因子-β1(TGF-β1)及其他信号传导通路：TGF-β1是一种影响同一细胞自分泌或邻近细胞旁分泌的分泌蛋白，具有促瘤或抑瘤作用。有研究证实miR-34a可通过抑制鼻咽癌细胞Smad4的表达，逆转转化生长因子-β诱导的鼻咽癌细胞的侵袭和迁移[34]。白细胞介素-6受体(IL-6R)作为miR-34家族成员的靶点，可介导信号传导和转录激活因子3(STAT3)的激活，而STAT3则通过保守的结合位点与miR-34a结合，抑制miR-34a的表达，而这种抑制作用是白细胞介素-6诱导的EMT和侵袭所必需的[35]。因此，IL-6R/STAT3/miR-34a构成了调控EMT以抑制肿瘤进展的反馈环。

3 ceRNA-miR-34a调控的新机制

ceRNA假说最初于2007年由Ebert等人提出，该假说认为mRNA、circRNA、伪基因转录本和LncRNA通过microRNA响应元件(microRNA responsive element，MRE)调控相互之间的表达，以竞争性结合miRNAs，目前已有大量研究支持该假说[11,36]。

LncRNA是指长度超过200个核苷酸的RNA，本身不编码蛋白质，与包括肿瘤在内的多种疾病有关。研究发现，Lnc015192及其靶基因Adam12通过ceRNA机制特异性结合miR-34a，促进乳腺癌转移。敲除miR-34a后，Adam12和Lnc015192显著上调，而敲低Adam12和Lnc015192则抑制乳腺癌细胞的迁移、侵袭和EMT。进一步的实验表明，Lnc015192通过作为miR-34a的ceRNA调控靶基因Adam12的表达[37]。SNHG7是另一种通过调节miR-34a促进肿瘤生长和EMT的LncRNA[38]。进一步研究发现SNHG7作为ceRNA，通过结合miR-34a增加大肠癌GALNT7的表达，即通过与内源性miR-34a竞争，调控PI3K/Akt/mTOR通路，促进细胞增殖和转移从而发挥致癌作用[39]。LncOC1通过结合miR-34a和另一miR-34c，促进卵巢癌细胞的增殖和迁移[40]。

circRNA是最近发现的另一种新型RNA，不同于众所周知的线性RNA，它形成一个共价闭合的连续环。通常circRNA分子中的3′和5′端连接在一起。内源性circRNA对核酸外切酶介导的降解具有抗性，鉴于其5′或3′端的缺失，可能比细胞中的大多数线性RNA更稳定[41]。circRNA在细胞质中富集，并与其线性mRNA广泛互补，显示了这些RNA可能通过结合microRNA发挥其功能。因此，circRNA在基因调控中具有潜在的重要作用[41]。研究发现，circRNA可以调节EMT，这表明一些circRNA可能影响EMT相关的细胞功能，包括癌变和转移[42]。最近研究表明，circRNA在肿瘤中起到miR-34a分子海绵的作用。circGFRA1和GFRA1在三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)中可能通过调节miR-34a发挥作用[43]。miR-34a也被证明可直接抑制大肠癌和乳腺癌中的乳酸脱氢酶A(LDHA)的表达[44]，以及肺癌和急性髓细胞白血病中重要的免疫检查点抑制剂PDL1的表达[45]。进一步研究表明，PDL1和LDHA均是通过调节miR-34a来促进TNBC细胞增殖和转移的ceRNA[46]。因此，同时针对PDL1和LDHA的靶向治疗，可能为乳腺癌特别是TNBC开辟一条新的治疗途径。另一种circRNA circNFIX通过Notch信号传导通路竞争性结合miR-34a-5p，以调节Notch1，最终促进胶质瘤的进展[33]。与正常脑组织相比，circNFIX在胶质瘤中过度表达，Notch信号传导通路在肿瘤组织中的表达明显上调。Si-circNFIX和miR-34a可促进细胞凋亡，而miR-34a抑制剂可抵消Si-circNFIX对胶质瘤细胞的抑制作用。体内实验进一步表明，Si-circNFIX通过调节miR-34a和Notch信号传导抑制胶质瘤细胞的生长[33]。总之，ceRNA通过特异性吸附miR-34a来调控基因表达，并在肿瘤发生、发展和EMT中发挥重要作用。

4 问题与展望

miR-34a作为肿瘤相关EMT的重要负性调节因子，在抑制肿瘤发生及转移方面发挥着相当重要的作用。miR-34a是一种很有前途的肿瘤抑制因子，而关于miR-34a的临床前期研究证实了其肿瘤抑制作用机制。随着miR-34a疗法的逐步应用，也出现了一些问题。首先，miRNA降解会阻止miR-34a穿透毛细血管内皮进入靶细胞。其次，miR-34a的免疫反应也值得重视。一项名为NCT02862145的临床试验由于发生了5次miR-34a免疫相关不良事件而被终止。如果miR-34疗法使用纳米载体，那么纳米粒子的毒性也值得商榷。再者，miR-34a治疗效果不佳的原因可能与EMT或肿瘤基因信号传导过程中，抑制肿瘤细胞miR-34a再表达有关，而miR-34a在正常细胞中的异常表达则可能是产生系统性不良反应的基础。ceRNA的作用机制涉及mRNA、circRNA、伪基因转录本和LncRNA表达的相互调节，在EMT过程中竞争性结合microRNA。因此，miR-34a和EMT之间的通路网络可能作为重要的生物学标志物或是精准治疗靶点，为恶性肿瘤诊断与治疗开辟了新的道路。