响应面法优化保加利亚乳杆菌发酵培养基的氮源

李晓军，马跃英，郭跃东，王海霞，冯 谦，邢会霞，马晓红，李康宁，黄少磊， 刘彦民

（内蒙古双奇药业股份有限公司，内蒙古呼和浩特 010010）

“金双歧” 是内蒙古双奇药业股份有限公司主导产品，是内蒙古自治区成立70 年来，企业自主研发并拥有自主知识产权的唯一一个国家一类新生物制品，其疗效确切，安全无毒副作用。金双歧所含3 种菌粉，长双歧杆菌菌粉、保加利亚乳杆菌菌粉、嗜热链球菌菌粉均为公司自行研制生产。随着 “金双歧” 销量的逐年递增，金双歧中3 种菌粉的生产需求量也随之增加，菌粉的产能由菌粉活菌数决定，而3 种菌粉中，保加利亚乳杆菌由于真空冷冻干燥后的菌体存活率比较低，导致菌粉活菌数相对较低，产能较其他菌粉落后。因此，将对保加利亚乳杆菌菌粉活菌数开展优化研究。大部分研究人员通过寻找最适的高密度培养方法来提高保加利亚乳杆菌发酵液活菌数，从而提高菌粉活菌数，或者通过优化保护剂配方来提高菌粉活菌数，亦或是两者相结合的方式[1-4]。都容易忽视发酵工艺对保加利亚乳杆菌抗冻性的重要影响，其中保加利亚乳杆菌发酵培养基组分与其在冷冻干燥过程中的存活率有着十分密切的联系[5-8]。培养基组分中碳氮源是最主要的影响因素，选择合适的碳氮源可增加细胞膜中不饱和脂肪酸的含量，从而增加菌体细胞膜的流动性，使得菌体的抗冻性得到提高[9]。另外，不同碳氮源会影响菌体的形态，形态的改变也会引起抗冻性的改变[10]。以保加利亚乳杆菌为出发菌株，通过Plackett-Burman试验设计，筛选出显著影响真空冷冻干燥后菌体细胞存活率的氮源物质，然后利用响应面方法优化所选有机氮源的复配比例，以期得到可提高冻干存活率的最优氮源组合。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 供试菌种保加利亚乳杆菌NQ2508，内蒙古双奇药业股份有限公司技术中心保存。

1.1.2 培养基

改良MRS 培养基：酪蛋白胨4 g，牛肉膏8 g，葡萄糖12 g，K2HPO42 g，柠檬酸二铵2 g，乙酸钠5 g，吐温-80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，碳酸钙2g，蒸馏水1000 mL，pH 值6.6。

MRS 检测培养基：在以上改良MRS 培养基的基础上加入琼脂粉15 g。

冻干保护剂配方：脱脂乳200 g，乳糖12 g，谷氨酸钠10 g，抗坏血酸10 g，蒸馏水1 000 mL。

1.1.3 试剂

牛肉膏、牛肉浸粉、酵母粉、牛肉蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白胨，荣氏生物制品（苏州） 有限公司提供。

1.1.4 仪器及设备

J2-21 型离心机、BCN-1360 型超净台、1029 型厌氧培养箱、 2014-025Bb 型真空冷冻干燥机、PB-10 型酸度计等。

1.2 试验方法

1.2.1 保加利亚乳杆菌的培养及冻干

将保加利亚乳杆菌菌种在MRS 液体培养基中活化2 代后，按5%的接种量分别接种于含不同氮源物质的MRS 培养基中，厌氧培养箱于37 ℃下培养。培养至对数生长后期时，各发酵液于4 ℃下以转速8 000 r/min 离心20 min，弃去上清液，离心得到的菌体以2 倍质量的保护剂悬浮，然后进行真空冷冻干燥（预冻：-40 ℃，2 h；升华干燥：-30～-8 ℃，8 h；解析干燥：8～25 ℃，4 h）。得到的冻干粉进行活菌数检测，并计算菌体冻干存活率。菌体冻干存活率的计算方法为：

1.2.2 试验设计

以保加利亚乳杆菌真空冷冻干燥后菌体冻干存活率为响应值，首先利用Plackett-Burman 设计法从各氮源物质因素中筛选出显著影响因素，再利用响应面方法（RSM） 中的Box-Behnken 设计进行试验，通过试验数据拟合得到二阶响应面模型，最终确定最优氮源物质组成，并进行验证。用Design Expert 8.0 软件作为试验设计和数据分析的软件工具。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman 试验设计筛选显著影响因素

选定N=12 的Plackett-Burman 试验设计，对酪蛋白胨、牛肉浸粉、大豆蛋白胨、牛肉蛋白胨、牛肉膏、酵母粉等6 个因素进行显著性影响因子筛选，各因素均取2 个水平：高水平 “+” 和低水平 “-”。

Plackett-Burman 试验因素水平见表1，Plackett-Burman 试验设计结果见表2，Plackett-Burman 试验设计各因素的方差分析见表3。

表1 Plackett-Burman 试验因素水平

表3 Plackett-Burman 试验设计各因素的方差分析

由表3 的方差分析可以看出，对保加利亚乳杆菌冻干存活率有显著影响的氮源依次是酵母粉、酪蛋白胨和牛肉浸粉，其他因素均不显著。这3 个因素的估计系数均为正值，说明试验中所定的这3 种氮源质量浓度有些偏低，下一步优化中应适当地提高浓度。

2.2 Box-Behnken 优化设计结果与响应面分析

选用三因素三水平， 17 个试验点的Box-Behnken 设计，其中5 个为中心点。

Box-Behnken 试验设计因素与水平设计见表4，Box-Behnken 试验设计结果见表5。

表4 Box-Behnken 试验设计因素与水平设计

表5 Box-Behnken 试验设计结果

对表5 的试验数据进行二次回归拟合，得到的二次方程模型为：

Y=90.35+2.56A+6.45B+3.54C+2.37AB-2.64AC-2.16BC-3.86A2-4.92B2-1.16C2.

式中： Y——响应值菌体冻干存活率，%；

A，B，C——分别代表酵母粉、酪蛋白胨和牛肉浸粉的添加质量浓度，g/mL。

响应面回归方程方差分析见表6。

表6 响应面回归方程方差分析

由表6 可知，多元相关系数R2=99.49，说明模型对实际情况的拟合度很好。模型项p 值（Prob＞F）＜0.000 1，说明模型显著，可用来进行响应值预测。一次项、二次项的F 检验均极显著，说明所选择的酵母粉、酪蛋白胨和牛肉浸粉3 种因素对菌体冻干存活率的影响都极显著；由交互项的F 检验可知酵母粉与酪蛋白胨、酵母粉与牛肉浸粉、酪蛋白胨和牛肉浸粉对菌体冻干存活率影响的交互作用极显著。

酵母粉和酪蛋白胨对菌体冻干存活率影响的等高线图及响应面图见图1，酵母粉和牛肉浸粉对菌体冻干存活率影响的等高线图及响应面图见图2，牛肉浸粉和酪蛋白胨对菌体冻干存活率影响的等高线图及响应面图见图3。

图1 ～图3 是多元回归方程式所做的等高线图和响应面图，由此可对任何两因素交互影响菌体冻干存活率进行分析与评价，以确定最佳因素水平范围。通过软件计算得到，酵母粉质量浓度0.46 g/100 mL，酪蛋白胨质量浓度0.52 g/100 mL，牛肉浸粉质量浓度0.93 g/100 mL 时，预测菌体冻干存活率最大值为93.75%。以筛选出的最佳质量浓度配比，做3 组重复验证试验，平均菌体存活率为92.98%，与预测值非常接近，说明通过响应面法建立的数学模型准确可靠。

3 结论

通过Plackett-Burman 试验研究了各种氮源物质对菌体冻干存活率的影响程度，结果表明酵母粉、酪蛋白胨和牛肉浸粉对保加利亚乳杆菌的冻干存活率具有显著性影响。通过Box-Behnken 设计试验进一步优化了氮源组成，即当酵母粉、酪蛋白胨和牛肉浸粉的质量浓度分别为0.46，0.52，0.93 g/100 mL 时，冻干后保加利亚乳杆菌具有最大存活率为93.75%，实测值平均为92.98%，与理论预测值较为接近。说明该模型准确可靠，具有实际应用意义，为保加利亚乳杆菌培养基的进一步优化奠定了良好的基础。