基于高光谱成像技术的进口冰鲜牛肉新鲜度指标检测

孙宗保，梁黎明，闫晓静，邹小波，王天真，刘小裕，李君奎

（江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013）

在我国，牛肉需求远超过国内供给，并且供需差距不断扩大[1]，进口牛肉成为解决供需矛盾的重要途径。冰鲜牛肉因其新鲜、柔嫩等特点深受消费者喜爱[2-3]，但牛肉在非冷冻条件下腐败速度较快，保鲜时间相对较短，在一定程度上制约了其在市场上的发展。进口牛肉市场上存在不法商贩为了谋取利益以次鲜肉冒充新鲜肉售卖，这不仅损害消费者利益，还可能导致食品安全问题的发生。因此有必要对不同贮藏时间冰鲜牛肉的品质检测进行研究。

目前对肉品品质的研究仍主要采用感官评定、理化指标检测和微生物检测等常规方法[4]。感官评价有主观性强等缺陷，理化检测与微生物检测多数需要复杂的操作步骤，具有样品处理繁琐、检测周期长等问题[5]。为了满足肉类品质快速检测与准确分析的要求，无损检测技术逐步代替常规检测方法运用到肉品品质安全检测中。其中高光谱成像技术将光谱与二维成像技术结合在一起，不仅可以获得样本在每个波段下的图像信息并用于样品的外部特征研究，还可以提取图像上每个像素点的光谱信息并用于样品的内部品质研究[6-8]。高光谱成像技术在肉品品质检测方面已有较多应用[9]。Kamruzzaman等[10]利用高光谱成像技术识别碎牛肉中是否掺假鸡肉及其掺假浓度；Crichton等[11]利用高光谱成像技术检测不同贮藏条件下的牛肉的pH值，成功分离出变质牛肉；Foca等[12]研究证明高光谱成像技术可以预测干切火腿表明乳酸菌的数量。现阶段对牛肉单一或多种指标检测的研究很多，但在从众多理化指标中筛选出不同贮藏时间的冰鲜牛肉之间的新鲜度特征指标的研究还很少。通过对特征指标含量的预测可以进一步研究不同贮藏时间冰鲜牛肉的品质差异。

本研究以不同贮藏时间的冰鲜牛肉为研究对象，重点研究牛肉贮藏过程中挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）[13]、颜色（L*、a*、b*）、脱氧肌红蛋白（deoxymyolglobin，DMb）、氧合肌红蛋白（oxymyoglobin，OMb）和高铁肌红蛋白（metmyoglobin，MMb）含量的变化，并找出不同贮藏时间冰鲜牛肉的新鲜度特征指标，然后利用高光谱成像技术预测新鲜度特征指标含量，比较不同预测模型的预测效果。最后利用最佳预测模型计算新鲜度特征指标含量，结合图像处理方法完成特征指标含量的分布可视化[14]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

澳大利亚进口冰鲜牛腱肉购自上海新臻元食品有限公司。牛肉样品在冰箱冷鲜层（（4±0.5）℃）进行不同时间（1、15、30、45、60 d和90 d）的冷藏，记为F-1、F-15、F-30、F-45、F-60、F-90。

氧化镁、硼酸、甲基红指示剂、溴甲酚绿指示剂、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钾、无水乙醇（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；盐酸标准溶液上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

高光谱成像系统主要组成硬件包括：ImSpector V10E CCD摄像头 芬兰Specim公司；SC30021A精密电控平移台、SC300-1A电子控制箱 北京卓立汉光仪器有限公司；Fiber-Lite DC-950 Illuminator 150 W光纤卤素灯美国Dolan-Jenner公司。

Color Quest XE分光测色仪 美国Hunter Lab公司；A25-Digital分散机 上海欧河机械设备有限公司；TGL-16MC离心机 长沙湘锐离心机有限公司；V-5100B分光光度计 上海元析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样本的预处理

实验前在无菌冷藏室去掉样本中可见的脂肪、结缔组织等，切成3 cm×3 cm×2 cm表面平整的块状样本，编号后进行指标测定。每个贮藏时间下含有30 块样本，测定颜色（L*、a*、b*）并采集高光谱图像后，再将其利用绞肉机充分搅碎后进行TVB-N和肌红蛋白（DMb、OMb和MMb）的测定。

1.3.2 理化指标测定

1.3.2.1 TVB-N含量的测定

参考GB 5009.228—2016《食品中挥发性盐基氮的测定》中的半微量定氮法进行测定。

1.3.2.2 颜色的测定

L*、a*、b*代表物体颜色的色度值，其中L*代表明暗度（黑白），a*代表红绿色，b*代表黄蓝色。利用分光测色仪测定牛肉样本的L*、a*、b*值。待测色仪开机、校正后，对每个肉样在不同肌肉部分测定3 次取其平均值。

1.3.2.3 肌红蛋白含量的测定

参照Krzywicke[15]的方法，首先将肉样充分搅碎，取4 g碎肉加入20 mL、0.04 mol/L的磷酸钠缓冲液（pH 6.8）中，然后用分散机在室温下10 000 r/min均质15 s。将均质液在4 ℃冰箱中冷藏1 h后使用离心机在5 000 r/min、4 ℃条件下离心20 min。最后将上清液过滤，使用分光光度计分别在525、545、565、572 nm波长处测量滤液的吸光度。肌红蛋白含量按照以下公式计算：

式中：P1、P2、P3分别为DMb、OMb、MMb的质量分数/%；R1、R2、R3分别为吸光度比值A572/A525、A565/A525、A545/A525。

1.3.3 高光谱成像采集

高光谱采集参数设置为：曝光时间45 ms，图像分辨率618×1 628，平移台速率为90 mm/s，光谱分辨率2.8 nm，光谱波长范围为431～962 nm，采样间隔0.858 nm。高光谱数据采集后将得到一个三维图像数据块。样本采集过程中的噪声、暗电流会对图像造成影响，因此对原始图像进行校正后再提取数据。利用ENVI软件打开牛肉样本标定后的高光谱图像，采用矩形工具选取每个样本中心附近的200×200感兴趣区域（region of interest，ROI），计算ROI内的所有像素点的光谱反射率作为此样本的光谱数据。

1.4 数据处理与分析

1.4.1 统计分析方法

采用偏最小二乘法进行定量模型的构建。使用SPSS 25.0软件对实验数据进行单因素方差分析，通过Duncan新复极差法进行显著性分析，P＜0.05，差异显著；并使用SPSS进行Pearson相关性分析。

1.4.2 光谱预处理方法

本实验选用的预处理方法包括一阶导数（first derivative，1st Der）、二阶导数（second derivative，2nd Der）、均值中心化（mean centering，MC）、多元散射校正（multiplicative scatter correction，MSC）、卷积平滑（savitzky-golay，SG）、标准正态变量变换（standard normal variate transformation，SNVT）和归一化（normalization，N）。将未经预处理组分设置为对照组。

1.4.3 特征变量提取方法

区间偏最小二乘（interval partial least squares，iPLS）方法：将整个光谱区域分成若干个等宽子区间，对每个子区间构建偏最小二乘回归模型，采用留一法交互验证计算交叉验证均方根误差（root mean square error of cross validation，RMSECV）值，根据RMSECV最低的原则确定最佳建模区间[16]。

竞争性自适应重加权算法（competitive adaptive reweighted sampling，CARS）是一种蒙特卡罗（Monte Carlo）结合偏最小二乘（partial least squares，PLS）回归系数的特征波长选择方法。它可以有效去除无关变量，减少共线性变量的影响[17]。

1.4.4 样本集的划分

采用Kennard-Stone划分样本集，以2∶1的比例划分训练集和预测集，得到120 个样本作为训练集，60 个样本作为测试集。

2 结果与分析

2.1 理化指标测定结果分析

为获得较好的新鲜度预测性能，利用显著性和相关性分析从诸多新鲜度指标中筛选出与贮藏时间相关性最优的特征指标，然后利用预测模型计算新鲜度特征指标含量，最后结合图像处理方法完成特征指标含量的分布可视化，以此获得表征牛肉新鲜度的最优可视化图像。

图1 不同贮藏时间冰鲜牛肉的TVB-N含量Fig. 1 TVB-N content of chilled beef during different storage times

从图1可以看出，冰鲜牛肉的初始TVB-N含量为8.35 mg/100 g。随着贮藏时间的延长，冰鲜牛肉中的TVB-N含量显著性增加（P＜0.05），与肉品腐败程度呈正相关[18-20]。当贮藏时间为45 d时，TVB-N含量接近15 mg/100 g，贮存至60 d时，TVB-N含量已经超过国家规定。

图2 不同贮藏时间冰鲜牛肉的颜色参数值Fig. 2 Color parameters of chilled beef during different storage times

由图2可知，随着贮藏时间的延长，冰鲜牛肉的L*值变化波动较大，贮藏初期（1、15 d）与后期（60、90 d）的L*值差异具有显著性（P＜0.05）。b*值在贮藏15 d后达到最大，随后逐渐降低，这与肉中微生物的繁殖以及水分损失有关。a*值整体上一直减小，但是在贮藏中期（15、30、45 d）变化不显著（P＞0.05）。其原因是贮藏时间的延长对氧合肌红蛋白的形成不利，并且贮藏后期细菌的大量繁殖，促进了高铁肌红蛋白的形成[21]，使牛肉a*值下降。

3 种肌红蛋白的颜色分别为：DMb暗红色（紫红色）、OMb鲜红色、MMb灰棕色（褐色）。根据谢小雷等[22]研究，OMb经氧化后生成MMb，而MMb经过高铁肌红蛋白还原酶系统的作用可以被还原为OMb，这两个反应同时进行。由图3可知，不同贮藏时间的OMb含量差异最显著，经短暂上升后逐渐下降。MMb含量变化与OMb正好相反，先下降后逐渐上升，导致肉色变暗、a*值下降。这与González-Calvo等[23]研究结果相符。

图3 不同贮藏时间冰鲜牛肉的DMb、OMb和MMb含量Fig. 3 DMb, OMb and MMb contents of chilled beef samples during different storage times

2.2 新鲜度特征指标筛选

对比图1～3的显著性分析结果，发现不同贮藏时间的TVB-N含量差异最显著。如表1所示，TVB-N、DMb和MMb与贮藏时间呈正相关，L*、a*、b*和OMb与贮藏时间呈负相关。另外，通过对比相关系数发现，TVB-N、b*、a*的相关系数均大于0.8。因此本研究从显著差异性、正负相关性、相关系数3 个方面综合考虑，选取TVB-N、a*和b*作为不同贮藏时间冰鲜牛肉的新鲜度特征指标。

表1 贮藏时间与理化指标间的相关系数Table 1 Correlation coefficients between storage time and physicochemical indexes

2.3 光谱数据预处理

图4 冰鲜牛肉样本的原始光谱图（a）与平均光谱图（b）Fig. 4 Raw Spectra (a) and average spectra (b) of chilled beef samples

从图4可以看出，不同贮藏时间牛肉样本之间的光谱曲线具有相似的趋势，但是反射率存在差异。在560 nm波长附近主要是脱氧肌红蛋白的吸收峰，700 nm波长附近的光谱吸收与NH3基团的三级倍频吸收有关，800 nm波长附近的光谱吸收主要与水分子中O—H键的二级倍频吸收有关[24-26]。光谱信息中存在着部分与样本自身性质不相关的冗杂信息，这会影响模型的稳定性与预测的准确度[27-28]。因此采用7 种不同的预处理方法（1st Der、2nd Der、MC、MSC、SG、SNVT和N）对原始光谱数据进行预处理。

2.4 新鲜度特征指标含量预测

根据2.2节的结论，将TVB-N、a*和b*作为不同贮藏时间的冰鲜牛肉的新鲜度特征指标。利用PLS、iPLS、CARS-PLS模型对上述指标含量进行预测。在建立模型之前，采用Kennard-Stone方法进行样本集划分，且训练集中样本的每个特征指标含量范围包含测试集中样本对应的指标含量，有助于预测模型精度的提升。

2.4.1 TVB-N含量的预测

2.4.1.1 PLS模型预测结果

如表2所示，当原始光谱数据经过SNVT方法预处理后，PLS模型的预测效果较好，训练集和测试集的相关系数rc和rp分别为0.938 2、0.925 4，RMSECV值和RMSEP值分别为1.46、1.49 mg/100 g。后续实验采用SNVT方法进行预处理。

表2 不同预处理方法建立TVB-N含量PLS模型预测结果Table 2 Predictive results of PLS model for TVB-N content with different preprocessing methods

2.4.1.2 iPLS模型预测结果

首先将预处理后的618 个变量分成10～30 个区间，然后对每一区间建立PLS模型。当i=10时，主成分数为8，RMSECV值最小为0.851 7 mg/100 g，如图5a所示。此时iPLS筛选的最优子区间为第4个，图5b显示了最优子区间的位置，对应波长范围587.36～639.17 nm，一共62 个变量。将这些变量组合成新矩阵并建立PLS预测模型，预测结果如图5c、d所示。与全光谱变量建立的预测模型结果相比较，训练集和测试集的识别率均有不同程度的下降。这是因为，虽然iPLS在提取变量过程中去除了大量的变量，但提取出来的变量是连续的，相邻或者相互之间可能会存在高度相关性[29]。

图5 TVB-N含量的iPLS模型的最佳主成分（a）、最优子区间（b）、训练集（c）和测试集（d）散点图Fig. 5 iPLS model for TVB-N content: optimum PCs (a), optimum subintervals (b), and scatter plots of training (c) and test set (d)

2.4.1.3 CARS-PLS模型预测结果

图6 TVB-N含量的CARS-PLS模型的变量选择Fig. 6 CARS-PLS model results of TVB-N content

利用CARS筛选波长时，采样次数设置为100，运行结果如图6和图7所示。图6a为不同采样次数下选取的变量数量，其随采样次数的增加逐渐减小；由图6b可知，RMSECV值随着采样次数的增加先减小后增大，当采样次数为35时，RMSECV值最小；图6c表示波长选择过程中不同波长变量对应的回归系数的变化路径，*表示RMSECV值最小的位置，此时共筛选得到65 个波长。将这65 个特征波长变量组合后建立PLS预测模型，结果如图7所示，rc和rp分别为0.965 8和0.963 7，RMSECV值和RMSEP值分别为1.06、1.12 mg/100 g。与全光谱建模结果相比，预测精度有所提高。说明通过CARS方法去除无关变量后，可以简化模型，降低模型的计算量，提高运算效率并提高模型预测精度[30-31]。

图7 TVB-N含量的CARS-PLS模型的最佳主成分数（a）、训练集（b）和测试集（c）散点图Fig. 7 CARS-PLS model results of TVB-N: optimum PCs (a), and scatter plots of training (b) and test set (c)

2.4.2a*和b*值的预测结果

2.4.2.1 PLS模型预测结果

表3 a*和b*值的PLS模型预测结果Table 3 Predictive results of PLS models for a* and b* values

如表3所示，对照组对a*的预测结果最好，说明利用原始光谱数据建立a*的PLS预测模型效果最佳，rc和rp分别为0.930 1、0.914 8，RMSECV值与RMSEP值分别为0.85、0.90；MSC是预测b*值的最佳预处理方法，rc和rp分别为0.912 8和0.902 0，RMSECV值与RMSEP值分别为1.04和1.24。

2.4.2.2 iPLS、CARS-PLS模型预测结果

表4 a*和b*值的iPLS、CARS-PLS and iCARS-PLS模型结果Table 4 Results of iPLS, CARS-PLS and iCARS-PLS models for a* and b * values

利用iPLS和CARS方法分别对经过上述最佳预处理方法处理后的数据进行特征提取，然后将变量组合成新数据矩阵并建立a*和b*值PLS预测模型，结果如表4所示。相比于iPLS和全光谱建立的PLS模型结果，CARS-PLS模型的预测精度有非常明显的提升。此时对a*值和b*值进行预测时，rc分别为0.949 5、0.964 2，rp分别为0.949 4、0.942 3，RMSECV值分别为0.71、0.76，RMSEP值分别为0.72、0.77。

2.5 新鲜度特征指标含量分布可视化

利用CARS-PLS模型实现TVB-N、a*和b*值的可视化分布，便于更加直观地分析牛肉的品质变化。

如图8所示，随着贮藏时间的延长，图像颜色由蓝色逐渐转为黄色。图8e、f基本为绿色和黄色，与图8a～d差异明显。对应的牛肉样本TVB-N含量均值大于15 mg/100 g，牛肉新鲜度明显降低。

图8 不同贮藏时间牛肉中TVB-N的可视化分布图Fig. 8 TVB-N distribution maps of beef samples at different storage time pints

在图9a、b中，黄色像素点和红色像素点居多，a*值较大；图9c红色像素点基本消失，以黄色和浅蓝色像素点为主；图9d～f中像素点由浅蓝色逐渐向深蓝色转变，表明a*值随着贮藏时间的延长逐渐下降。

图9 不同贮藏时间牛肉中a*值的可视化分布图Fig. 9 a* Distribution maps of beef samples at different storage time points

图10 反映了b*值变化情况。随着贮藏时间的延长，图像颜色整体由黄色向蓝色转变。其中，图10a、b中黄色像素点增多，b*值增大，而图10b～e中黄色像素点不断减少，蓝色像素点不断增多，表明贮藏15 d后b*值开始减小。

图10 不同贮藏时间牛肉中b*值的可视化分布图Fig. 10 b* Distribution maps of beef samples at different storage time points

因此，通过新鲜度特征指标的可视化分布图可以更直观地看出冰鲜牛肉在贮藏过程中新鲜度的变化趋势，帮助消费者以及生产者判断牛肉的新鲜程度。

3 结 论

本研究以不同贮藏时间的冰鲜牛肉为研究对象，采集样本的高光谱图像、测定并分析样本的TVB-N、颜色参数（L*、a*、b*）、DMb、OMb和MMb含量变化，结果表明TVB-N、a*、b*值与贮藏时间呈现较好的相关性，选取了TVB-N、a*和b*作为不同贮藏时间的冰鲜牛肉的新鲜度特征指标。同时利用光谱数据对特征指标含量进行预测，最佳预测模型均为CARS-PLS。此时，模型的rp分别为0.963 7、0.949 4、0.942 3，RMSEP分别为1.12 mg/100 g、0.72、0.77。利用CARS-PLS模型结合图像处理绘制了特征指标含量可视化分布图，可以直观地看出冰鲜牛肉在贮藏过程中新鲜度的变化趋势。结果表明，高光谱成像技术结合化学计量学方法可以实现冰鲜牛肉新鲜度指标的快速检测及其分布可视化。