基于适配体杂交链式反应检测郫县豆瓣中黄曲霉毒素B1

黄玉坤，陶 璇，邵 坤，王 冲，王力均，车振明，陈祥贵,

（1.西华大学食品与生物工程学院，四川 成都 610039；2.宜宾西华大学研究院食品非热加工重点实验室，食品非热加工工程技术研究中心，四川 宜宾 644004）

黄曲霉毒素是一类化学结构相似的化合物，为二氢呋喃香豆素衍生物，其热稳定性非常强[1]。在1993年被世界卫生组织癌症研究机构划定为一类天然存在的致癌物，是毒性极强的剧毒物质[2]，其中黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）的毒性最强[3]。黄曲霉毒素中毒的最主要途径是食物中毒，世界各国相继出台了食品中黄曲霉毒素限量标准。中国与美国对淀粉类制品（饼干、面包、蛋糕）、发酵食品（酱油、醋、豆豉、酱）、粮食产品（麦粉、面粉）等的AFB1限量为不超过5 μg/kg[4]，欧盟则规定不得检出。郫县豆瓣作为川菜发酵调味品，在发酵过程中起主要作用的微生物是曲霉属。由于传统生产工艺仍然比较粗放，在发酵过程监控不够严格和标准化的情况下，产品极易被黄曲霉污染而产生黄曲霉毒素[5-6]。因此，AFB1污染情况已作为郫县豆瓣地理标志产品标准（把豆瓣地理标准列在这里）中的质量合格要求之一进行监测。但是，由于豆瓣富含蛋白质、氨基酸、酶、色素、脂类等成分，检测基质非常复杂，实现对豆瓣中AFB1有效检测面临较大挑战。因此，研究建立一种准确、稳定、高效、快速、低成本的针对郫县豆瓣中AFB1的检测方法变得非常必要。

核酸适配体是由一般不超过100 个碱基组成的单链脱氧核糖核苷酸（ssDNA）或核糖核苷酸（RNA），能特异性结合靶标物质[7]。近年来，适配体逐渐被应用到食品安全检测领域[8-9]。目前，基于AFB1适配体的检测方法有比色传感检测法[10]、竞争性酶联适配体检测法[11]、电化学检测法[12]、毛细管电泳检测法[13]等。杂交链式反应（hybridization chain reaction，HCR）无需酶的参与，其原理是利用一条单链DNA引发2 条探针之间发生杂交反应，形成超长双链[14-15]。该反应通过对单链核苷酸进行扩增或自组装以扩大信号，提高检测方法的灵敏度[16]。操作简单、条件温和，因此广泛用于食品安全检测[17-18]。Xu Yangyang等[19]以适配体为引发剂，构建了基于HCR荧光信号放大的检测方法，用于检测葡萄球菌肠毒素B；Yu Shuang等[20]建立了基于适配体的HCR，并用于检测沙门氏菌；Wang Bin等[21]应用HCR技术研制了检测赭曲霉毒素A的超灵敏适配体传感器；Zhang Zhen等[22]将Hg2+介导的适配体与HCR信号放大反应结合，建立了谷胱甘肽的荧光检测方法，但鲜见该反应用于AFB1高灵敏快速检测方法的建立。

本研究基于适配体识别作用构建郫县豆瓣中AFB1的HCR检测体系。该体系主要由AFB1适配体、互补链（cDNA）、氧化石墨烯（graphene oxide，GO）、FAM标记的发夹1（HP1）和发夹2（HP2）组成。在此体系中，无AFB1存在时，HP1荧光被淬灭；AFB1存在时，HP1荧光恢复。在一定范围内，荧光强度与样品中AFB1的含量呈线性关系。最后将该方法用于多种郫县豆瓣样品中AFB1的测定，旨在为复杂基质的样品中AFB1的检测提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

AFB1标准储备液（1 mg/mL）、黄曲霉毒素B2（aflatoxin B2，AFB2）标准储备液（1 mg/mL）、赭曲霉毒素A、赭曲霉毒素B、玉米赤霉烯酮、伏马毒素 上海源叶生物科技有限公司；AFB1试剂盒 江苏苏微微生物研究有限公司；琼脂糖、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）（99.5%） 阿达玛斯试剂公司；GO 南京先丰纳米材料科技有限公司；DNA Marker（100～600 bp和100～1 200 bp） 北京天根生化科技有限公司；不同品牌（大弘润、川堰、品乐、真的老、丹丹、鑫宏丹、蜀味源、丽通、蜀城、鹏胜、川溪、鹃城）的郫县豆瓣购于本地超市；缓冲液（10 mmol/L Tris、5 mmol/L KCl、20 mmol/L CaCl2、120 mmol/L NaCl，pH 7.2）。

AFB1的适配体序列[23]及相关序列设计方法参考Chen Lu等[24]的报道。所有DNA序列经生工生物工程（上海）股份有限公司合成和高效液相色谱纯化。合成DNA的序列见表1。

表1 本实验所用的DNA序列Table 1 DNA sequence used in this study

1.2 仪器与设备

恒温混匀仪 杭州奥盛仪器有限公司；琼脂糖水平电泳仪 北京东南仪诚有限公司；VILBER FUSION SL4化学发光及多色荧光成像系统 锘海生物有限公司；Fluoromax-4荧光光谱仪 美国HORIBA集团公司。

1.3 方法

1.3.1 琼脂糖凝胶电泳

使用前将HP1和HP2在95 ℃变性10 min，然后缓慢冷却至室温。在缓冲液存在下，1 μmol/L cDNA；1 μmol/L HP1；1 μmol/L HP2；1 μmol/L HP1和HP2；1 μmol/L HP1、1 μmol/L HP2和不同浓度的cDNA，分别在37 ℃振荡孵育1 h。DNA产物通过琼脂糖凝胶电泳进行表征。用1×TAE缓冲液（40 mmol/L Tris-乙酸盐，1 mmol/L EDTA和20 mmol/L乙酸）制备2%琼脂糖凝胶，110 V电压下电泳40 min，并在荧光成像仪紫外光下成像。

1.3.2 基于适配体的HCR体系检测AFB1方法建立

使用前将HP1与HP2在95 ℃变性10 min，然后缓慢冷却至室温。将不同浓度的AFB1标准溶液与40 nmol/L适配体溶液混合，在37 ℃振荡孵育30 min；加入50 nmol/L cDNA溶液，继续振荡孵育30 min；再加入60 nmol/L HP1和HP2，孵育1 h。最后加入50 μg/mL GO溶液。加入缓冲液至总体积为500 μL，在37 ℃振荡孵育30 min后测定荧光强度。荧光光谱仪测定条件：激发波长为480 nm，发射波长的范围为500～600 nm。

1.3.3 基于适配体的HCR体系检测AFB1方法的特异性评价

选择5 种常见的真菌毒素（AFB2、赭曲霉毒素A、赭曲霉毒素B、玉米赤霉烯酮、伏马毒素）作为干扰物质，质量浓度均为50 ng/mL。采用1.3.2节检测方法进行特异性检测。

1.3.4 豆瓣样品中AFB1的检测应用

称取10.0 g豆瓣样品，粉碎后加入50 mL 50%甲醇溶液和20 mL正己烷，振荡15 min后转入分液漏斗中待分层。收集下层溶液10 mL旋转蒸发浓缩后，加入10 mL 10%甲醇-Tris-HCl复溶。然后将不同浓度的AFB1标准溶液添加到1 mL样品液中。对每个样品进行3 次标准添加和回收实验，计算回收率。HCR方法与GB 5009.22—2016《食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》中的酶联免疫吸附法[25]试剂盒同时测定12 种不同品牌的郫县豆瓣中AFB1的含量。

1.4 数据分析

利用Excel处理数据，用Origin 8.0软件作图。用Duncan多重比较进行显著性分析，P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 基于核酸适配体的HCR体系的传感策略设计原理

本实验基于核酸适配体的HCR体系检测AFB1的原理如图1所示。该传感器主要由AFB1适配体、cDNA、HP1和HP2组成。cDNA与AFB1适配体可通过氢键作用部分杂交配对[19]，HP1和HP2与cDNA完全互补配对并可自身部分互补形成“发夹”结构的探针。HP1的5’末端（a链）修饰荧光分子FAM，3’端（b链）有6 个未配对的碱基作为黏性末端。cDNA通过与HP1的b链配对引发a与b解链。发夹结构HP1中被暴露出的a链与HP2中的a’链互补配对而引发HP2的b’与a’解链。HP2解链后的b’链会再次与HP1杂交，如此反复自组装，发生HCR，形成超长双链DNA，该双链DNA上有多个有机荧光素FAM。GO对单链DNA具有很强的吸附性能。HP1的黏性末端通过π-π堆积作用被吸附到GO表面，其末端的荧光基团FAM与GO发生荧光共振能量转移，荧光被淬灭[26-28]。GO对双链DNA的吸附能力弱，因此发生HCR反应后的超长双链中FAM的荧光被淬灭的程度显著降低[29]。当不存在靶标AFB1时，cDNA不能触发HCR的HP1与HP2结合，HP1关闭，荧光信号较低。当存在靶标AFB1时，适配体-AFB1的亲和力高于适配体-cDNA，cDNA触发HP1与HP2互补配对，HP1被打开并恢复荧光信号，从而实现对AFB1的定量分析。

图1 基于适配体的CR体系检测原理图Fig. 1 Schematic illustration of the principle of hybridization chain reaction based on aptamer

2.2 序列设计

图2 单链DNA的二级结构图Fig. 2 Secondary structures of single-stranded DNA

本实验中的HP1、HP2、cDNA通过NUPACK软件设计得到，通过Mfold软件模拟序列的二级结构如图2所示，HP1和HP2为发夹结构，cDNA为与AFB1部分互补的短链。该预测结果与实验设计的理想结构相符。

2.3 基于适配体的HCR检测体系的验证

琼脂糖凝胶（质量分数2%）用于表征和验证HCR扩增和基于适配体的HCR系统。由图3可知，当不存在cDNA时，只有一条清晰的条带（泳道e），HP1和HP2未发生杂交，没有高分子质量DNA产物生成。加入不同浓度的cDNA时，泳道f～i有高分子质量的DNA生成，这表明cDNA的存在引发了HCR，并且随cDNA浓度的降低呈现平均分子质量增加的趋势[30]。

图3 HCR产物的琼脂糖凝胶电泳图Fig. 3 Agarose gel electrophoresis images of nucleic acids in HCR products

由图4a可知，FAM在480 nm波长处受到激发后在波长516 nm左右具有最高的荧光强度。由图4b可知，GO在500～700 nm波长范围内都具有光吸收特性，与FAM标记发生荧光共振能量转移，进而引起荧光淬灭。

图4 FAM被GO淬灭前后的荧光光谱（a）和GO的紫外-可见吸收光谱图（b）Fig. 4 Fluorescence spectra of FAM before and after quenching by GO (a) and UV-visible absorption spectrum of GO (b)

图5 进一步验证了基于适配体的HCR系统（AFB1适配体、cDNA、HP1、HP2、GO、AFB1的浓度分别为20 nmol/L、20 nmol/L、60 nmol/L、60 nmol/L、20 ng/mL、20 ng/mL）。未加入GO时，FAM的荧光不被淬灭，荧光强度较高（图5a）。加入GO后，HP1和HP2被吸附到GO表面，FAM荧光被淬灭，荧光强度明显降低（图5b）。加入cDNA时，cDNA引发了HP1和HP2之间的HCR，发夹探针的荧光得到恢复（图5c）。当靶标AFB1存在时，适配体与AFB1结合使得更多的cDNA引发HCR，生成多个聚合双螺旋DNA，荧光强度显著增强（图5d）。由此证明了该方法的可行性。

图5 不同反应体系的荧光响应Fig. 5 Fluorescence responses of different reaction systems

2.4 HCR实验条件优化

2.4.1 互补短链cDNA的浓度优化

图6 引发探针cDNA与适配体的浓度对荧光信号的影响Fig. 6 Effect of concentration of cDNA and aptamer on fluorescence signal

cDNA作为HCR的引发链，其浓度对双链DNA产物的形成和荧光信号的强弱有着直接影响，本实验中固定适配体为40 nmol/L，优化了cDNA的浓度。如图6所示，随着cDNA的浓度增大，荧光强度显著升高。当cDNA与AFB1适配体浓度比达到1.25后，荧光强度缓慢升高，这表明cDNA引发HP1和HP2杂交产生的双链产物几乎达到了饱和状态。因此，选用浓度比为1.25时的cDNA浓度（50 nmol/L）为最佳反应浓度。

2.4.2 HP1和HP2浓度优化

在HCR体系中，HP1与HP2之间进行互补错位杂交，因此将HP1和HP2以1∶1的浓度比混合参与反应。如图7所示，荧光强度随着反应体系中HP1与HP2的浓度增大而增强。当HP1与HP2浓度达到60 nmol/L时反应体系的荧光强度最强，当HP1与HP2浓度继续增大，荧光强度降低。荧光强度降低可能是核酸浓度太高产生了空间位阻，导致杂交链的形成受到影响[19,31]。因此选择60 nmol/L的浓度作为最佳反应浓度。

图7 发夹探针P1/P2的浓度对荧光强度的影响Fig. 7 Effect of concentration of hairpin probe HP1/HP2 on fluorescence intensity

2.4.3 杂交孵育时间优化

图8 cDNA与P1/P2杂交时间对荧光强度的影响Fig. 8 Effect of hybridization time on fluorescence intensity

由图8可知，荧光强度随着孵育时间的延长而增强。当孵育时间达到60 min后，荧光强度降低，说明孵育时间在60 min左右HCR已经几乎达到饱和状态，因此选择60 min作为最佳杂交孵育时间。

2.4.4 GO质量浓度优化

图9 GO质量浓度对荧光强度的影响Fig. 9 Effect of GO concentration on fluorescence intensity

如图9所示，当GO质量浓度小于50 μg/mL时，荧光信号逐渐降低；当质量浓度超过50 μg/mL时，荧光信号基本不再变化。因此GO的最佳质量浓度为50 μg/mL。

2.5 荧光信号响应与校准曲线

在上述最佳的实验条件下研究了校准曲线和灵敏度。如图10a所示，随着一系列AFB1浓度的增加，荧光强度增加。图10b显示构建的基于AFB1适配体的HCR检测系统的荧光强度与AFB1质量浓度之间的线性关系。结果显示，AFB1在2～60 ng/mL范围内具有良好的线性关系，相关系数R2=0.971，线性回归方程为Y=755.28X＋49 448.17，检测限为1.84 ng/mL。如表2所示，与其他快速检测方法相比，本实验具有较高的灵敏度。

图10 不同质量浓度AFB1存在下CR的荧光强度（a）及其线性关系（b）Fig. 10 Fluorescence spectra of hybrid chain reaction at different concentrations of AFB1 (a) and linear relationship (b) between fluorescence intensity and AFB1 concentration

表2 现有检测AFB1方法的灵敏度比较Table 2 Comparison of the sensitivity of currently available methods for the detection of AFB1

2.6 方法特异性实验

如图11所示，由于AFB1和AFB2分子结构具有较高相似性，该检测方法基于构象识别的原理表现为对AFB2存在18.92%的交叉反应率，与其他真菌毒素无显著交叉反应，表明方法的特异性强，可用于检测AFB1。

图11 CR检测体系的特异性评价Fig. 11 Specificity evaluation of the HCR detection system

2.7 基于HCR的荧光检测法检测郫县豆瓣样品中的AFB1

通过向某个豆瓣样品中添加AFB1标准溶液，使最终加标质量浓度分别为4、15、30 ng/mL，采用本实验所建立的HCR法进行检测，每个样品做3 次平行实验。如表3所示，本方法的加标回收率在85.73%～94.25%之间，相对标准偏差在3.24%～6.05%之间，表明该方法具有较好的准确度，可用于豆瓣样品中AFB1的检测。

表3 加标回收率（n=3）Table 3 Recoveries of AFB1in spiked samples (n= 3)

对购买于本地超市的12 种不同品牌的郫县豆瓣样品进行实际样品的检测分析，结果见表4。10 个样品检测出AFB1，平均污染水平为3.42 μg/kg，最高污染水平为4.50 μg/kg，与GB 5009.22—2016酶联免疫吸附法相比，二者测定结果无显著差异（P＞0.05）。所有样品的检测均未超出国标限量（5 μg/kg），说明这12 种来自不同品牌的郫县豆瓣AFB1污染程度较小。

表4 郫县豆瓣中AFB1测定（n=3）Table 4 AFB1contents in Pixian broad-bean paste determined by the developed method and the national standard method (n= 3)

3 结 论

本研究建立了基于AFB1核酸适配体的HCR荧光检测方法。通过优化实验条件，最终确定cDNA浓度50 nmol/L；HP1和HP2浓度60 nmol/L；孵育时间60 min；GO质量浓度50 μg/mL。该方法的检测限为1.84 ng/mL，线性范围为2～60 ng/mL，R2=0.971。 该方法在实际样品郫县豆瓣中的加标回收率为85.73%～94.25%。该方法用于12 种不同品牌的郫县豆瓣的检测，10 个样品检测出AFB1，平均污染水平为3.42 μg/kg，最高污染水平为4.50 μg/kg，与GB 5009.22—2016酶联免疫吸附法试剂盒检测结果无显著差异。本研究建立的检测方法操作简单，选择性强，无需标记AFB1核酸适配体，不影响核酸适配体的结构变化，不干扰其与AFB1的结合。同时，采用HCR体系扩大信号，提高了检测方法的灵敏度，为复杂基质样品中AFB1的检测提供了新的检测方法。