沙门氏菌污染豆腐干和牛肉干后代谢物的研究

胡 蝶， 胡 昊， 杨本芹， 潘学军

（昆明理工大学 环境科学与工程学院，云南 昆明650500）

豆腐干和牛肉干均是即食性食品，营养丰富，在制作、运输及储存过程中都有被致病菌污染的风险[1-7]，评估此类即食食品的污染现状十分重要。

目前的研究多数局限于已发生沙门氏菌病的病情调查和检测可能被污染致病菌的食品中微生物的存在，但关于沙门氏菌污染食品后的代谢物的研究还较少。作者选取豆腐干和牛肉干作为沙门氏菌的接种培养基，并用气相色谱-质谱法（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）鉴定沙门氏菌污染豆腐干和牛肉干后的代谢物。因GC-MS的分辨率好，灵敏度高，数据库较为健全，近年来被广泛使用[8-9]。作者基于GC-MS检测技术的代谢组学分析平台研究沙门氏菌分别在污染豆腐干和牛肉干后的特征性和差异性代谢产物[10]，以期能够为沙门氏菌的典型代谢物的筛选提供参考，并为筛选沙门氏菌污染食品后的潜在生物标志物提供理论和实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

沙门氏菌（ATCC14028S）：购自中国普通微生物保藏管理中心；营养肉汤培养基：购自百思生物公司；豆腐干和牛肉干：市售；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）：美国西格玛公司产品；二氯甲烷（色谱纯）、2，4，6-三甲基吡啶：迈瑞达公司产品。

1.2 沙门氏菌的培养

选取沙门氏菌作为研究用菌株。首先将购买的菌株在37℃下水浴解冻，转移1 mL沙门氏菌菌液至200 mL NB培养基置于37℃培养箱温育24 h进行增菌[11]。增菌后观察菌落形态、是否有杂菌，若无杂菌即可保藏以进行后续培养实验。

豆腐干和牛肉干均与超纯水按1 g∶10 mL的比例混合，然后搅拌10 min，18目筛网重复过滤，使豆腐干和牛肉干颗粒直径小于1 mm，确保制成的培养基足够均匀，121℃，103 kPa灭菌30 min待用。取20 mL配好的NB培养基、豆腐干培养基（DB）、牛肉干培养基（BJB）分别测定pH值[12]和总有机碳。

将-80℃保藏的菌种复苏后取1 mL菌液分别加入到200 mL NB、DB、BJB中，在37℃培养箱内培养12 h。取部分菌液在营养琼脂培养基在37℃下培养48 h后进行计数[13]，另外取10 mL菌液用于代谢组学分析。每组实验以空白培养基为对照，分别做6个平行。

1.3 基因组测序

首先对沙门氏菌的基因组进行片段化，构建基因组文库，然后对单链DNA片段进行扩增，激光扫描后读取核苷酸种类，重复读取，获得模板DNA片段的序列。利用Illumina Hiseq平台对沙门氏菌的基因进行测序，然后对原始数据进行质控，统计和基因组评估，完成denovo组装，随后可对测序数据进行基因功能预测。

1.4 GC-MS鉴定代谢物

1.4.1 代谢物的提取 取10 mL菌液于50 mL离心管中，迅速加入体积分数为60%的10 mL冷甲醇溶液（-40℃）后涡旋30 s并超声处理2 h，置于-80℃冰箱中冷冻12 h放入冷冻干燥机冷冻干燥。冷冻干燥后的样品加入10 mL乙腈、甲醇和超纯水（体积比为2∶2∶1）萃取剂，振荡后将混合液倒入带有3种规格玻璃球的试管分散机（UTTD）中破碎10 min。将破碎后的样品置于37℃培养箱中反应2 h，将混合液在-4℃、10 000g的条件下离心15 min，取上清液，真空冷冻干燥。将冷干样品加入2 mL二氯甲烷，混匀，加入50μL 2，4，6-三甲基吡啶作为内标，进行GC-MS测定。

1.4.2 GC-MS操作条件GC-MS使用DB-624毛细管色谱柱；柱温升温程序为初始温度40℃保持6 min，10℃/min升温至230℃，保持10 min。载气为高纯氦气；载气流量为2.0 mL/min。进样口温度230℃，进样量1.0μL，采用不分流模式。质谱条件：离子源温度230℃；质谱接口温度230℃；全扫描模式，质量扫描范围29～350。

1.5 数据处理

通过美吉生物云平台（www.majorbio.com）利用基因组序列信息对基因功能进行预测，并找到相关代谢酶的信息。代谢物质谱数据的处理采用Agilent MSD Productivity Chem Station（Agilent Technologies Inc.USA）联合NIST 2014质谱数据库进行原始峰提取、数据基线过滤、基线标准、峰对齐、峰识别和峰面积集成，相似度＞70%的物质被认为是可信物质。识别出的代谢物利用SIMCA14.1软件包进行主成分分析 （Principal components analysis，PCA）和正交偏最小二乘判别（Orthogonal Partial Least Squares Discrimination Analysis，OPLSDA）分析，将OPLS-DA模型中的预测值（VIP＞1）中第一个主成分和单因素方差分析（P＜0.05）相结合，鉴定出主要差异代谢物[14]，比较得出的差异代谢物在KEGG数据库搜索代谢物途径，研究不同食品被沙门氏菌污染后主要的代谢通路和潜在生物标志物[15]。使用Origin9.0软件作图。

2 结果与讨论

2.1 营养肉汤培养基、豆腐干培养基、牛肉干培养基的相关参数

NB、DB、BJB的pH值，TOC值如表1所示。3组培养基的pH分别属微酸微碱性，张旭东等[16]表明pH值在5～7时，沙门氏菌均能正常生长。3组培养基的TOC值说明3组培养基提供的碳源相差不大，对沙门氏菌的生长不会有很大影响。按国标法测得3组培养基培养12 h后的最大菌落数。菌落数都能达到2.29×108CFU/mL，说明沙门氏菌的生长都是正常的，并未因其他理化性质不同明显影响沙门氏菌的生长状况。

表1 培养基的相关参数Table 1 Parameters of medium

2.2 代谢谱图

沙门氏菌污染食品后会充分利用营养物质进行生长，同时会代谢出多种代谢物，因此对沙门氏菌接种3个培养基12 h后的代谢物进行检测发现有491个有效峰，经过原始峰提取、数据基线过滤、基线标准、峰对齐、峰识别和峰面积集成，且相似度＞70%的峰有298个。如图1所示，将TIC色谱图叠放，可以直接反映每组代谢物的差异。

如图1（a），沙门氏菌接种于NB之后，相对于未接种沙门氏菌的NB、1-丁醇、均三甲苯可能是差异性代谢产物；如图1（b），沙门氏菌接种于豆腐干培养基（DS）之后，相对于空白豆腐干培养基（DB），甘油可能是差异性代谢产物；如图1（c），沙门氏菌接种于牛肉干培养基（BJS）之后，相对于空白牛肉干培养基（BJB），乙醇、甘油、2，4-二叔丁基苯酚可能是差异性代谢产物，作者将结合PCA和OPLSDA进行详细分析。

图1 典型GC-MS TIC叠放图Fig.1 Typical GC-MS TIC stacking map

2.3 沙门氏菌的特征性代谢产物

如图2所示，可以看出3组空白培养基和接种沙门氏菌的培养基的物质数量和总丰度。因NB、DB和BJB的营养成分有一定的差异[17-19]，因此接种沙门氏菌后降解产生的代谢产物必然有一定差异。结果如下：NB有125种物质检出，接种沙门氏菌的NB（SM）的代谢物有174种代谢物；DB检出159种物质，接种沙门氏菌的DB（DS）检出159种代谢物；BJB检出270种物质，接种沙门氏菌的BJB（BJS）检出84种代谢物。

图2 3组空白培养基和接种沙门氏菌的培养基鉴定的物质总量和总丰度Fig.2 Comparation of the total number and abundance of metabolites in three media with inoculated and without inoculation of S.typhimurium

图3 分别对3组未接种和接种沙门氏菌的培养基检测出的代谢物进行了OPLS-DA分析，以增强我们对沙门氏菌在不同培养基中产生的代谢物的了解。得分图中的所有样本都在95%的HotellingT平方椭圆内，并且在组间发现了明显的分离和区别。这些发现表明，OPLS-DA模型可用于识别本实验的代谢产物成对组之间的差异[20]。

如表2所示3组特征性代谢产物，即对未接种沙门氏菌的3组培养基的物质和接种沙门氏菌的培养基培养12 h后测出来的代谢物进行OPLS分析，VIP＞1和P＜0.05的物质即丰度差异显著的物质。SM的特征代谢物有20种，DS的特征代谢物有12种，BJS的特征代谢物有7种，这些代谢物主要是烷烃及部分小分子代谢物，如：乙醇、乙酸、甘油、丙二醇、1-丁醇等。表明沙门氏菌都显著降解了3个培养基中的物质且特征性代谢产物有所区别。

首先，沙门氏菌接种NB，DB，BJB产生的特征性代谢产物都包含大量的烷烃和芳香族物质。由KEGG知烷烃主要参与脂肪酸降解，角质、丝氨酸和蜡生物合成和次级代谢产物的生物合成三大代谢途径，Piao表明烷烃是牛肉中脂质氧化形成的主要挥发性化合物[21]，且革兰氏阴性菌都有将醛类物质降解为烷烃的能力[22]，因此3组培养基的特征性代谢产物都含有烷烃（表2）。而芳香族物质的存在应该是NB培养基的大分子芳香族物质被降解。

其次，1-丁醇同时是3个培养基被沙门氏菌接种后的特征性代谢产物，因此1-丁醇有可能成为沙门氏菌降解的典型代谢物。另外，豆腐干和牛肉干接种沙门氏菌后的特征性代谢产物还有甘油，甘油是一种常见的细胞代谢产物，存在于各种生物体中[23]，豆腐干和牛肉干的特征性代谢产物中同时含有甘油，可能是因为两者制作过程中加入脂肪，被沙门氏菌大量降解为短链脂肪酸及甘油。

图3 OPLS-DA得分图Fig.3 OPLS-DA score plot

表2 NB、DB、BJB中的特征性代谢产物Table 2 Characteristic metabolites of NB and SM，BD and BS，BJB and BJS

乙酸、乙醇等小分子大多都是生物进行基本生命活动的产物，因此每组培养基的特征性代谢产物还有一些特殊的小分子醇酸酮。NB培养基中的乙酸、丙酸；豆腐干培养基的丙二醇、乙酰胺、3-甲基-2-丁酮、棕榈酸甲酯、麦芽酚；牛肉干中的乙醇及两种酮类可能是沙门氏菌降解牛肉干的特征性代谢物。

2.4 沙门氏菌的差异性代谢产物

有机体摄入外源物质或发生病变时，对机体稳态产生干扰，反映其基因或蛋白质转录发生的变化，代谢产物的种类或数量发生变化即为差异性代谢产物。因NB培养基有充足的碳源和氮源，且理化性质适合多数菌株，因此将接种于NB培养基的沙门氏菌降解产物看作是对照，即差异性代谢产物在具体指将SM和DS、SM和BJS的代谢物分别进行OPLS分析，其VIP＞1，P＜0.05即认定为差异性代谢产物。SM、DS、BJS的代谢物PCA分析如图4（a）所示，沙门氏菌在3组培养基能显著分开，说明沙门氏菌污染不同食品产生的代谢产物是有差异的。SM与DS和BJS的OPLS-DA分析分别如图4（b），图4（c），可以看到，两两培养基的代谢物有明显差异。进一步的S-plot分析可得出差异性代谢产物。

图4 PCA和OPLS-DA得分图Fig.4 PCA and OPLS-DA score plot

如表3所示，SM和DS的差异性代谢产物有31种，SM和BJS的差异性代谢物有32种，且差异性代谢产物种类和上述沙门氏菌的特征性代谢产物（表2）类似，有大量的烷烃和芳香类化合物。除上述两类物质外，SM和DS的差异性代谢物有醋酸、异佛尔酮、1-丁醇，SM和BJS的差异性代谢物有丙酸、1-丁醇、乙酰胺、吡咯并[1，2-a]吡嗪-1，4-六氢-二酮、2-吡咯烷酮、乙醇、二氢-2，4（1H，3H）-嘧啶二酮。从表中可以看出不同食品的差异性代谢产物都有1-丁醇和2，4-二叔丁基苯酚。

2.5 沙门氏菌的代谢系统分析

沙门氏菌的全基因组序列全长4 864 529 bp，共包含5 048个基因。随后对得到的编码基因进行功能KEGG注释，如图4。沙门氏菌的基因中代谢（metabolism）相关的基因有1 924个，环境信息处理（Environmental Information Processing）相关的基因有456个，基 因 信 息 处 理 （Genetic Information Processing）相关的基因有231个，细胞过程（Cellular Processes）相 关 的 基 因 有225个。可 见，代 谢（metabolism）相关的基因占比最大，其中又以碳水化合物的代谢（Carbohydrate metabolism）和全局和概览图（Global and overview maps）的基因居多，分别有497和303个基因。

表3 沙门氏菌在不同培养基的差异性代谢产物Table 3 Differential metabolites in different medium with S.typhimurium

将SM和DS的差异性代谢产物进行代谢通路分析（www.metaboanalyst.ca），表明主要参与丙酮酸代 谢 （Pyruvate metabolism） 和 糖 酵 解/糖 异 生（Glycolysis/Gluconeogenesis），而基因信息表明参与这两条代谢路径的关键酶分别有50和40条，都包含在碳水化合物的代谢里。将SM和BJS的差异性代谢产物进行代谢通路分析，表明主要参与丙酸盐代谢（Propanoate metabolism）和糖酵解/糖异生，而基因信息表明参与这两条代谢路径的关键酶分别有40和50条，都包含在碳水化合物的代谢中。

图5 沙门氏菌基因组的KEGG注释Fig.5 KEGG annotation of S.typhimurium genome

3 结语

综上所述，1-丁醇和2，4-二叔丁基苯酚同时是沙门氏菌接种于豆腐干和牛肉干培养12 h后的差异性代谢产物。首先，KEGG数据库（http：//www.kegg.jp/）并没有收录2，4-二叔丁基苯酚相关的代谢信息，只在沙门氏菌的基因信息中发现芳香化合物的降解（Degradation of aromatic compounds）有11个关键酶涉及芳香化合物的代谢。其次，KEGG数据库表明1-丁醇主要参与丁酸代谢（Butanoate metabolism）、不同环境的微生物代谢（Microbial metabolism in diverse environments）及芳香族化合物的降解（Degradation of aromatic compounds）3个代谢路径，而沙门氏菌的KEGG基因注释也表明沙门氏菌中有28个丁酸代谢相关基因和11个芳香族化合物的降解的相关基因，见表1和表2。此外，1-丁醇的代谢过程也可能会受到沙门氏菌中CoA酰化醛脱氢酶的影响[24]。有研究表明，微生物Enteromorpha intestinalis[25]和Clostridium acetobutylicum[26]也能产生1-丁醇，因此1-丁醇是沙门氏菌污染豆腐干和牛肉干后的典型代谢物，但能不能作为沙门氏菌的潜在标志物还有待进一步研究。

作者利用GC-MS技术分别在不同的培养基中检测到了100种左右的代谢产物，有大量的烃类物质和芳香族物质参与反应。沙门氏菌的基因注释表明碳水化合物的代谢的基因占比更多，且有39个有关1-丁醇的基因，结合沙门氏菌的特征性代谢产物和差异性代谢产物表明1-丁醇是主要的代谢物。因此1-丁醇是沙门氏菌污染食品的典型代谢物，但要确定其是否是潜在生物标志物还需要进一步研究。本研究为筛选沙门氏菌污染食品后的潜在生物标志物提供一定的实验依据。