蛹虫草及其下脚料水提物联合壳聚糖涂膜对西葫芦保鲜效果的影响

石 浩， 张 慜*

（1.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡214122；2.江南大学 食品学院，江苏 无锡214122）

西葫芦含有大量蛋白质、碳水化合物、维生素和钙元素而深受广大消费者青睐[1]，然而西葫芦在生长、收获、包装运输以及储藏过程中，会由于微生物繁殖、氧化应激反应等原因，使果实质量下降，影响其食用和商业价值[2]。采用冷藏的方法可减缓西葫芦在采后运输储藏过程中出现的品质劣变现象，但会带来另外的问题，如冷冻伤害、嗜冷微生物繁殖等[3-4]。

壳聚糖作为一种理想涂层，因其优良的抗菌性能可用于延长果蔬货架期，另外壳聚糖本身可以与其他功能性天然食品添加剂一起作为成膜剂[5-6]。蛹虫草（Cordyceps militaris，CM）是中国传统的食药两用真菌，含虫草素（3′-脱氧腺苷）、腺苷、虫草酸、超氧化物歧化酶和蛹虫草多糖等活性成分[7]。蛹虫草提取物具有抗炎、抗氧化和免疫调节等生物活性。而蛹虫草下脚料是蛹虫草固体培养后去除子实体后留下的子座和部分固体培养基组成的混合物，含有核苷类抗菌性物质，如虫草素等[8-9]。超微粉碎技术是一种新型的制粉技术，处理后的材料粒径可达到0.1μm，在此粒径下粉末能够表现出优异的性质，如更高活性成分溶出率和更强的抗氧化性[10]。

作者研究的目的是探求蛹虫草及其下脚料超微粉末的水提物联合壳聚糖涂膜对西葫芦冷藏期间的保鲜效果。评估了不同涂膜剂的抗氧化与抑菌性质及西葫芦品质参数变化，为西葫芦贮藏及保鲜提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

西葫芦：市售。挑选无机械损伤、无病虫侵染、成熟度基本一致的西葫芦作为试验材料；蛹虫草及其下脚料：湖南炎帝生物技术有限公司提供（下脚料主要包括蛹虫草收割后残留的子座及微量固体培养基）；壳聚糖、DPPH、冰乙酸、抗坏血酸、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、醋酸钠、PEG、聚乙烯吡咯烷酮、Triton X-100、愈创木酚、邻苯二酚等试剂均为国产分析纯；大肠杆菌（Escherichia coli）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、 金 黄 色 葡 萄 球 菌（Staphylococcus aureus）、变异链球菌（Streptococcus mutans）均为作者所在实验室保藏。

1.2 仪器与设备

CJM-SY-A高能纳米冲击磨：秦皇岛市太极环纳米制品有限公司产品；UV-1780紫外可见分光光度计：日本岛津公司产品；PL203电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司产品；TA.XT.Plus物性分析仪：英国Stable Mico System公司产品；TDL-60B台式离心机：上海安亭科学仪器厂产品。

1.3 蛹虫草及其下脚料水提物提取

将蛹虫草及其下脚料60℃烘干至恒重，剪成小段并研磨20 min，在（2±1）℃下超微粉碎处理4 h得到最终粉末。按照料液比1 g∶40 mL，在60℃条件下水浴提取2 h，过滤取滤渣按照相同条件提取2 h，合并两次滤液，60℃下通过旋转蒸发浓缩至100 mL，得到1 g/mL的浓缩水提液，冷藏备用。

1.4 不同涂膜剂的制备及活性测定

1.4.1 不同涂膜剂的制备5种处理组涂膜剂的配制如下：壳聚糖涂膜剂（Chi）制备：先配置体积分数为1%的冰乙酸溶液，再加入质量分数为1%的壳聚糖，在60℃下磁力搅拌至完全溶解，并在4℃下静置；蛹虫草水提物涂膜剂（CM）制备：将蛹虫草浓缩水提液与蒸馏水按照体积比1∶99配置成体积分数为1%的蛹虫草水提液，4℃下静置过夜备用；下脚料水提物涂膜剂（SS）制备：类似CM制备方法；壳聚糖复配蛹虫草水提液涂膜剂（Chi+CM）制备：将体积分数1%壳聚糖涂膜剂与质量分数1%蛹虫草水提物涂膜剂按照体积比1∶1混合，搅拌均匀后4℃下静置备用；壳聚糖复配蛹虫草下脚料水提液涂膜剂（Chi+SS）制备：类似Chi+CM制备方法。对照组涂膜剂为蒸馏水。

1.4.2 不同涂膜剂的抗氧化能力测定 涂膜剂的抗氧化活性参照文献[11]确定，使用DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基清除率法，以维生素C（VC）为阳性对照。

1.4.3 不同涂膜剂的抑菌能力测定 参照文献[12]并稍作修改，主要采用抑菌圈法测定。

1.5 不同涂膜剂涂膜处理的西葫芦品质测定

1.5.1 西葫芦涂膜处理 处理组：每次随机挑选西葫芦置于5种涂膜剂中浸泡2 min后取出并自然晾干；对照组：随机挑选西葫芦以蒸馏水处理相同时间并自然晾干，每个处理重复3次。将处理后的所有样品用聚乙烯袋包装，包装置于6℃下冷藏，在不同时间测定相关指标。

1.5.2 失重率 采用差量法测定[13]。

1.5.3 色泽 采用色差计法[13]。每个处理组测定8次西葫芦赤道附近4个方位的L*、a*和b*值。

1.5.4 硬度 参照文献[14]并有所修改，采用质构仪测定。

1.5.5 可溶性固形物 采用手持式折光仪测定[15]。

1.5.6 维生素C含量 参考曹建康等的方法进行测定[15]。

1.5.7 丙二醛含量 参考曹建康等的方法进行测定[15]。

1.5.8 过氧化物酶（POD）活性 参考曹建康等的方法并稍作修改[15]。

1.5.9 多酚氧化酶（PPO）活性 参考曹建康等的方法并稍作修改[15]。

1.5.10 菌落总数 参照王国英的方法测定[16]。

2 结果与分析

2.1 不同涂膜剂抗氧化性及抑菌能力测定

2.1.1 不同涂膜剂对DPPH清除能力测定 不同涂膜剂在不同质量浓度下对DPPH的清除能力如图1所示，所有涂膜剂的DPPH清除能力在0～1.0 mg/mL范围内随质量浓度增加而增加。当质量浓度为1.0 mg/mL时，Chi，CM，SS，Chi+CM和Chi+SS的自由基清除能力分别为22.42%，43.31%，39.18%，46.90%和33.38%，均明显低于VC（99.76%）。而单独CM的DPPH自由基清除能力强于SS以及Chi+SS，与Chi联合后抗氧化能力显著提高（P＜0.05）。可能是CM中的活性成分与壳聚糖分子协同作用，并且壳聚糖分子表面积较大，使CM更加均匀地分布于溶液中。以上结果与ZHANG Hao等人发现类似[17]。

图1 不同质量浓度涂膜剂DPPH清除率变化Fig.1 Effect of different coating concentration on the scavenging rate of DPPH

2.1.2 不同涂膜剂抑菌能力测定 不同涂膜剂的抑菌能力如表1所示，Chi+SS对于大肠杆菌的抑制作用明显低于其他涂膜剂（P＜0.05），而其他涂膜剂之间差异不显著（P＞0.05）；而对于铜绿假单胞菌菌来说，Chi+SS和Chi+CM的抑菌效果明显高于其他实验组（P＜0.05）；对于金黄色葡萄球菌和变异链球菌来说，CM和SS抑菌效果不明显，而Chi+CM抑菌能力明显强于其他涂膜剂（P＜0.05）。总体看来Chi+CM对于革兰氏阳性菌抑制作用强于对革兰氏阴性菌的抑制作用，并且强于CM、SS以及Chi单独作用时的效果。CM对大肠杆菌抑制效果较好，结合Chi后对实验所用4种菌都具有广泛的抗菌活性，DONG Caihong发现CM甲醇提取物对于大多微生物具有良好的抗菌活性，原因可能与提取剂有关[18]。

2.2 不同涂膜处理对冷藏条件下西葫芦品质的影响

2.2.1 失重率的变化 由图2可知，随着储藏期的延长，西葫芦的质量损失率显著增加（P＜0.05）。其中对照组在整个储藏期过程中质量损失率明显高于其他实验组，当储藏期超过16 d时，对照组和SS的质量损失率显著高于其他处理组，而Chi+CM组失水率最低，可能是西葫芦经蛹虫草活性水提物质和壳聚糖涂膜后，能够改变果蔬内部的气体成分起到类似气调包装储藏类似的效果，减少了西葫芦表面水分的挥发[19]。

表1 不同涂膜剂对4种细菌抑菌圈直径的影响Table 1 Effect of different coating agents on the diameter of inhibition zone of four bacteria

图2 不同涂膜处理对西葫芦失重率的影响Fig.2 Effect of coating treatments on the weight loss of zucchini

2.2.2 色泽的变化 图3显示了不同涂膜处理条件下西葫芦在储藏期间颜色参数的变化情况，主要包括ΔL*，Δa*和Δb*。从图3（a）中可以发现，西葫芦冷藏条件下的亮度值随着储存时间的延长先增加后减少，第24天时，CM和Chi+CM处理组的亮度变化值明显小于其他组，分别为-1.25±0.233和-0.215±0.199。而从图3（b）中可以看出，西葫芦表面的Δa*值随储藏时间增加，12 d后CM组和SS组样品的红绿值变化最小。到24 d，对照组样品的绿值下降最大达到4.51±0.11，显著高于其他组（P＜0.05）。而SS和CM组的绿色值得到了较好的保护，最终变化值＜2。图3（c）显示的是不同实验处理对西葫芦表面黄蓝值随变化的影响，样品黄值随时间的延长而不断增加，当储藏时间超过12 d时，对照组和SS组的Δb*显著高于其他实验组（P＜0.05）。在第24天，Chi组，CM组，Chi+CM以及Chi+SS组西葫芦黄值变化量显著低于对照组和SS实验组（P＜0.05），但这4组之间的差异不明显（P＞0.05）。相比于对照组，经过CM涂膜处理能够有效减缓西葫芦储藏过程中亮度值和绿值的下降速率，降低黄值的变化幅度。这主要是因为CM及SS水提物中含有大量具有抗氧化活性或抗菌能力物质，如酚类、黄酮类和核苷类物质，这些物质可以延缓西葫芦中酚类物质的降低，抑制多酚氧化酶的活性和相关腐败微生物的繁殖，从而维持西葫芦在储藏过程中的新鲜色泽[20]。

图3 不同涂膜处理对西葫芦ΔL*、Δa*和Δb*影响Fig.3 Effect of coating treatments on theΔL*、Δa*、Δb*value of zucchini

2.2.3 硬度的变化 图4显示了不同涂膜处理对西葫芦在冷藏条件下表面硬度的影响，西葫芦表面硬度随着储藏时间的延长呈下降的趋势。第16天后，Chi+CM处理组样品的硬度值明显高于其他处理组（P＜0.05）；而对照组在15 d之前硬度值下降幅度小，20 d之后下降速率明显高于其他实验组（P＜0.05）。第24天时Chi+CM处理组西葫芦表面硬度值最高，Chi、CM和Chi+SS涂膜处理的实验组硬度值之间没有显著差异（P＜0.05），但均高于对照组，这与WILLEKE等发现一致。蛹虫草水提物联合壳聚糖涂膜处理能够有效延缓西葫芦表面硬度的下降，原因可能是蛹虫草提取物中的活性物质对果皮细胞壁中的果胶多糖具有保护作用，而果胶多糖的增溶和解聚作用能够延迟果实软化[2，13]。

图4 不同涂膜处理对西葫芦硬度影响Fig.4 Effect of coating treatments on the firmness of zucchini

2.2.4 可溶性固形物和VC质量分数的变化 图5（a）显示了冷藏条件下西葫芦中可溶性固形物质量分数随时间的变化。随着储存期增加，可溶性固形物先增加然后减少。Chi+SS和Chi+CM处理在第16天时具有最高的可溶性固形物质量分数，而其他处理组在第4天到第12天之间显示最高值。可溶性固形物质量分数主要与果蔬成熟度有关，表明CM和SS联合Chi处理能够有效延缓西葫芦的采后成熟时间，可能是西葫芦在发育过程中积累了大量糖。采摘后这些糖主要用来进行呼吸作用，而壳聚糖联合蛹虫草及其下脚料水提物涂膜能够在西葫芦表面形成一层致密具有还原作用的薄膜，能够减缓植物呼吸作用，从而减少贮藏过程中糖分的消耗，使可溶性固形物维持在较高水平。 有研究发现采用钙离子涂膜与气调结合也能够增加西葫芦TSS保留率[20]。

图5 （b）显示了不同涂膜处理的西葫芦冷藏条件下抗坏血酸质量分数的变化。随着储藏时间的延长，抗坏血酸质量分数一直减少，相较于其他组，12 d前CM处理组的抗坏血酸质量分数维持在较高水平，12 d后Chi+CM实验组抗坏血酸质量分数明显高于其他组（P＜0.05）。抗坏血酸易受环境中的活性氧（ROS）如过氧化氢（H2O2）、超氧化物和羟基自由基引起的氧化应激反应导致质量分数下降[21]。而CM中含有的抗氧化性成分能够作用于环境中的活性氧，进而降低西葫芦中抗坏血酸在贮藏过程中的损耗，另外CM联合壳聚糖后DPPH清除能力明显提升，因此Chi+CM涂膜处理能更好地延缓西葫芦中抗坏血酸降解。

图5 不同涂膜处理对可溶性固形物和西葫芦VC质量分数的影响Fig.5 Effect of coating treatments on the soluble solid and VC content value of zucchini

2.2.5 丙二醛含量的变化 如图6所示，西葫芦中MDA含量随储存期的增加而增加，对照组值在第8天后明显高于处理组。Chi+CM组储藏期间一直处于较低水平，第24天时西葫芦中丙二醛含量在所有处理组中最低。一般不同种类的西葫芦在冷藏条件下受到的冷害程度不同，受到的冷害程度越低果实MDA含量也越低[4]。该结果证明CM与Chi联合涂膜作为一种活性氧清除剂，能够有效减少西葫芦在冷藏期间因氧化应激和氧化损伤引起的外表损伤。另外也有研究表明，腐胺处理等措施也能够减少西葫芦冷藏过程中的氧化应激代谢产物，提高果实的耐冻属性[22-23]。

2.2.6 POD和PPO活性的变化 过氧化物酶（POD）是水果和蔬菜中一种重要的氧化还原酶，对外界刺激、病原菌侵染、贮藏环境、加工条件十分敏感[24]。图7（a）显示了不同涂膜处理对冷藏期间西葫芦POD活性的影响，西葫芦中的POD活性随时间增加不断上升，对照组在第20天达到峰值，且明显高于处理组（P＜0.05）。储藏8 d后，Chi和SS处理组西葫芦中POD活性与其他处理组开始出现明显差异（P＜0.05）。24 d时，Chi+CM组最低，而Chi、CM和Chi+SS组之间差异不明显（P＞0.05）。随着储藏时间增加，西葫芦受到低温胁迫也不断加深，POD活性上升明显，而壳聚糖以及蛹虫草水提物涂膜能保护西葫芦表面细胞膜，能够有效清除或者抑制西葫芦体内产生的自由基，延缓POD酶活上升，减轻冷害作用。张秀兰等人也发现赤霉素和壳聚糖联合涂膜处理能够延缓毛竹笋中POD酶活的增加，提升保鲜效果[25]。

图6 不同涂膜处理对西葫芦丙二醛含量的影响Fig.6 Effect of coating treatments on the malondialdehyde content value of zucchini

从图7（b）中可以看出，每个处理组西葫芦中的PPO活性随时间增加呈上升趋势，储藏16 d后，对照组的PPO活性显著高于其他处理组（P＜0.05），储藏结束时最高。其他处理组PPO活性显著低于对照组相（P＜0.05），但是各处理组之间差异并不明显（P＞0.05）。该结果说明CM，SS和Chi涂膜能在西葫芦表面形成保护屏障，减少氧气对西葫芦内部多酚物质的氧化破坏，延缓了PPO活性的变化从而减少褐变，这和之前观察到的西葫芦储藏期内颜色变化一致。也有研究发现壳聚糖和丙酸钙联合处理能够降低鲜切香蕉皮在储藏期间的PPO活性并且抑制了褐变和微生物活性[26]。

图7 不同涂膜处理对西葫芦过氧化物酶和多酚氧化酶活性的影响Fig.7 Effect of coating treatments on the activity of POD，PPO of zucchini

2.2.7 菌落总数的变化 微生物腐败是影响新鲜水果蔬菜贮藏品质的最重要因素之一。图8显示，储藏期间西葫芦表面的微生物数量不断增加，第24天时对照组样品中的微生物数量明显高于其他处理组，而Chi和Chi+CM处理组中的菌落总数保持在较低水平，这和不同涂膜剂抑菌能力的结果一致。CM结合壳聚糖涂膜处理可有效抑制西葫芦在冷藏过程中微生物的生长，原因是壳聚糖和CM均具有抑菌作用，且形成的Chi-CM复合膜结构致密能够减少空气中氧气进入果蔬内部，从而最终控制水果蔬菜中微生物的呼吸生长。

图8 不同涂膜处理对西葫芦菌落总数的影响Fig.8 Effect of coating treatments on the total numbers of colony of zucchini

3 结语

在Chi、CM、SS、Chi+CM和Chi+SS 5种涂膜剂中，Chi+CM复合涂膜剂的DPPH自由基清除能力较好，抑菌圈实验结果也证明壳聚糖与蛹虫草水提物复合涂膜能够提高壳聚糖对革兰氏阳性菌抑制能力。将5种涂膜剂应用于西葫芦，在6℃条件下冷藏24 d后发现，Chi+CM涂膜能够有效降低西葫芦在储藏期间的质量损失、褐变以及可溶性固形物和抗坏血酸质量分数的下降。通过形成致密的CMChi复合膜系统，能够减少因氧化应激和氧化损伤引起的MDA积聚以及POD和PPO酶活的上升，抑制西葫芦冷藏过程中微生物的繁殖。因此，壳聚糖联合蛹虫草提取物涂膜能够实现西葫芦冷藏过程中品质维持，为壳聚糖联合天然活性成分涂膜保鲜果蔬提供一定的依据。