噬菌体的生物学特性及其在畜禽健康中的应用
2020-12-13
(安徽省无为市动物疫病预防与控制中心,安徽 无为 238300)
噬菌体(bacteriophage)是一类能够感染细菌、真菌、藻类、放线菌或螺旋体等微生物的病毒总称,因部分种类能够引起宿主菌的裂解,故称为噬菌体。噬菌体通常存在于充满细菌群落的地方,如泥土、海水和动物肠道中。一战时期,英国科学家Twort和加拿大科学家d'Herelle[1]发现一些圆点能阻碍菌落生长,他们猜测其能够抑制或杀死细菌,于是命名为噬菌体。随后,越来越多的科学家分离并鉴定出了多种噬菌体。上世纪80年代以来,分子生物学快速发展,人类对噬菌体的研究发展到基因组分离、起源与进化,以及噬菌体与宿主之间相互关系等多个领域。目前,关于噬菌体的研究已深入到对人类疾病的预防与治疗,动物肠道健康,食品、动物产品及饲料中细菌的清除。本文就噬菌体的生物学特性进行探讨,同时综述其在畜牧生产中的应用,旨在为进一步利用噬菌体提供方向。
1 生物学特性
1.1 命名与分类
按照病毒核酸类型可以将噬菌体分为群Ⅰ(双股DNA 病毒,dsDNA)、群Ⅱ(单股 DNA 病毒,ssDNA)、群Ⅲ(双股RNA病毒,dsRNA)和群Ⅳ(单股RNA病毒,ssRNA);根据形态结构可以分为dsDNA类(包括肌尾病毒科、长尾病毒科、短尾病毒科、古病毒科、纺锤病毒科、覆盖病毒科、复层病毒科、脂毛病毒科和原体病毒科)、ssDNA类 (包括微小病毒科、丝状病毒科)、dsRNA类(囊状病毒科)和ssRNA类(光滑病毒科);根据繁殖特性分为裂解性噬菌体(lytic)和溶原性噬菌体(lysogenic)[2]。
1.2 结构组成
噬菌体因种类不同结构也有差异,但是绝大多数噬菌体都是由核酸部分和外壳部分组成。核酸部分主要是单链DNA或RNA、双链DNA或RNA其中的一种,外壳主要由蛋白质构成,它在与宿主菌表面受体结合中发挥作用,不同的噬菌体特异性主要由蛋白质结构决定。无尾噬菌体的结构为20面体的蛋白质外壳(外表由规律排列的蛋白亚单位-衣壳组成)和包裹在内部的核酸;有尾噬菌体结构包括20面体的头部、中空的针状结构及外鞘的尾部、尾丝和尾针组成的基部;线状体噬菌体则呈现由壳粒组成的盘旋状结构。
1.3 理化特性与生存环境
噬菌体的蛋白质外壳和核酸会受到温度、pH值及化学试剂的影响而发生改变。不同噬菌体结构蛋白对温度的敏感性存在一定差异。60℃10 min条件下,胎儿弧菌噬菌体 V-45(Campylobacter fetus)[3]完全失活,103 ℃嗜热芽孢杆菌噬菌体(Bacillus alcalophilus)失活[4],80 ℃大肠杆菌噬菌体 Bp6 失活[5]。同样,强酸或强碱一定程度上都会导致噬菌体失活。金黄色葡萄球菌噬菌体[6]在pH<4或pH>12条件下,或750 mL/L乙醇处理30 min后失活,而氯仿和DMSO对噬菌体的活性影响不大。耐药肺炎克雷伯菌噬菌体JD902[7]在pH<4或pH>12条件下失活。猪链球菌噬菌体SMP在50℃10 min条件下失活,pH<6或pH>10效价下降,但是对氯仿不敏感[8]。因此,可以看出大部分噬菌体的适宜温度和酸碱度趋于常温呈pH中性,而对化学试剂不敏感。
1.4 作用机理
1.4.1 感染过程。噬菌体感染细菌的过程主要分两类:一类是裂解性噬菌体,主要包括识别、吸附、注入核酸,复制病毒核酸,合成病毒其他物质、装配和释放;另一类是溶原性噬菌体,主要包括识别、吸附、注入核酸,前噬菌体进入宿主基因组,宿主细胞复制,环境诱导前噬菌体释放,复制病毒核酸,合成病毒其他物质、装配和释放。
通常情况下,有尾噬菌体基部的尾板中含有二氢叶酸还原酶及Zn2+[9],这些物质能够与细菌的细胞壁、夹膜、菌毛或鞭毛上存在的特异性受体 (蛋白质、多糖、脂多糖)特异性识别,并促发尾丝与细菌表面受体结合,从而吸附细菌。而后噬菌体尾管开通DNA通道,尾针接触细菌肽聚糖,激活溶菌酶结构,释放溶菌酶水解肽聚糖,尾针穿透细菌内膜,噬菌体DNA进入细菌。噬菌体DNA利用细菌RNA聚合酶合成自身mRNA,然后合成早期、中期和晚期蛋白。合成后噬菌体各部件有序装配,分头部装配、尾部装配、头尾结合和尾丝装配。最终装配完成的噬菌体通过穿孔素-裂解酶系统(Holins-Lysin system)水解细菌肽聚糖层,裂解宿主菌,从而释放子代噬菌体。
1.4.2 穿孔素-裂解酶系统(Holins-Lysin system)。穿孔素(Holins)是一种疏水性跨膜蛋白,主要功能是触发细菌裂解反应和形成跨膜通道,还具有体外裂菌功能。裂解酶(Lysin)是噬菌体在宿主细胞寄生的最后阶段裂解细菌的一种酶,又称为内溶素或溶胞壁酶,主要功能为水解细菌细胞壁肽聚糖结构。按裂解肽聚糖位点不同可以分为葡糖苷酶、酰胺酶、肽链内切酶和转糖基酶[10],其结构主要由催化区和结合区构成,并形成α螺旋和β转角。
噬菌体在宿主细胞内复制子代噬菌体,并形成“穿孔素-裂解酶系统”,最终裂解细菌,释放子代噬菌体。其过程为噬菌体的穿孔素和裂解酶基因在晚期利用宿主细菌合成穿孔素和裂解酶,穿孔素首先到达细菌细胞膜,形成同源低聚物,在特定时间形成跨膜通道。之后裂解酶通过该通道被释放至膜外破坏细胞壁,裂解宿主细胞,结束感染周期[11-13]。
但是在外界环境恶劣、不适应释放子代噬菌体条件下,噬菌体也会合成抗穿孔素,调控裂解过程,延长子代噬菌体在宿主细胞内的留存时间。其机理可能是噬菌体穿孔素基因存在于穿孔素和抗穿孔素双序列,首先合成的抗穿孔素以某种构相分布于细胞膜,穿孔素合成后优先与抗穿孔素结合。当外界条件允许时,膜发生去极化,抗穿孔素转化成与穿孔素相同的膜分布构象,并与穿孔素发挥相同的功能[8]。
2 在畜禽养殖中的应用
2.1 防控细菌感染
自噬菌体被发现以来,人类一直探索用噬菌体替代抗生素防治动物细菌感染。目前在畜牧生产中应用最广泛的噬菌体有大肠杆菌噬菌体、沙门氏菌噬菌体、空肠弯曲杆菌噬菌体、金黄色葡萄球菌噬菌体以及产气荚膜梭菌噬菌体等。Smith等[14]研究发现,在家畜养殖中饲喂含有大肠杆菌噬菌体的饲料能够明显降低猪腹泻;Albino等[15]研究表明,沙门氏菌噬菌体可以有效防止猪沙门氏菌感染;Varelaoritz[16]等确定金黄色葡萄球菌噬菌体可以治疗奶牛乳腺炎。Wagenaar等[17]研究表明,在家禽养殖中,单独或联合使用噬菌体可以有效防控鸡空肠弯曲杆菌;还有学者证实噬菌体可以替代抗生素用于治疗因产气荚膜梭菌导致的鸡坏死性肠炎;Huff等[18]通过气囊给药证实,噬菌体在防控鸡呼吸道感染大肠杆菌具有显著疗效。可以看出,噬菌体在防治畜禽常见疾病方面发挥出巨大作用。
2.2 改善肠道微生物菌群,调节机体健康
肠道是微生物聚集最丰富的场所之一,肠道内含有大量的细菌、真菌和病毒,改善畜禽肠道健康能够显著提高畜禽的生产性能。例如,仔猪在生长发育期间极易因腹泻导致死亡,家禽也容易因肠道疾病导致下痢和生长迟缓。利用噬菌体不仅能够杀死畜禽肠道内的有害细菌,而且能够显著调节畜禽肠道菌群平衡,维持肠道健康。研究表明,早期的肠道干预能够对动物肠道菌群形成长期影响,同时还可以与肠道直接相互作用,通过直接穿越、感染细菌、受体介导的内吞作用和巨噬细胞非特异性吞噬等形式穿过肠道上皮,进入动物血液、淋巴或内脏[19]发挥杀菌作用。
3 噬菌体杀菌的局限性与开发前景
噬菌体虽然在抑制细菌、改善畜禽健康中发挥重要作用,但是也存在局限和不足。首先绝大多数噬菌体的特异性较强,宿主范围窄,培养一种噬菌体往往只能抑制一种细菌,而且细菌还可能通过突变产生抗性,导致噬菌体失效。如果利用多种噬菌体混合发挥效用,可能会导致研究成本增加。其次噬菌体与细菌是相伴相生的,细菌死亡后噬菌体也将裂解,其携带的某些毒素因子可能会释放到畜禽体内而危害畜禽健康[20]。噬菌体死亡后,其蛋白成分可能成为抗原,引起机体免疫应答,清除这些异物会导致噬菌体的杀菌效果下降。
为了克服噬菌体的局限和不足,科学家们通过研究噬菌体作用机理,发现噬菌体发挥杀菌作用的主要过程是裂解酶水解细菌细胞壁,而大部分裂解酶本身对细菌的破坏远大于噬菌体,因此具有巨大的开发应用潜力。相比较于噬菌体,裂解酶具有以下几大优势:第一,裂解酶作用迅速高效,连续使用不会产生抗药性[21]。第二,裂解酶的裂解谱较噬菌体广,可以杀灭多种细菌,在杀菌和抑菌方面更具有优越性。第三,裂解酶适宜的温度和pH值与机体内环境接近,规模化生产的制剂能够高效、及时地发挥作用。因此,未来有可能研发出更多的裂解酶用于治疗畜禽细菌感染,改善动物健康。
4 小结与展望
综上所述,噬菌体作为一种天然的细菌病毒,越来越多地被应用于防控畜禽细菌感染。但是由于其自身存在的局限性,可能逐渐被裂解酶所替代。而噬菌体与畜禽健康作用机理的的研究还不够清楚,未来需要科学工作者更深入地研究噬菌体、细菌和机体的关系。