单细胞转录组测序技术在类风湿性关节炎的研究进展

李琼 陈宇婷 接力刚 毋静 杜红延

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是常见的自身免疫性疾病，主要累及四肢小关节，造成关节破坏和畸形、丧失劳动力甚至危及生命［1，2］。据统计，世界范围内RA 发病率约为0.5%～1.0%，在我国约为0.4%，患者超过500 万［1，3］。患者的关节滑膜中存在多种免疫细胞和成纤维细胞，其中特定细胞亚群介导的免疫反应失调可能在RA 发病机制中起重要作用。

单细胞转录组测序（single cell RNA sequence，sc RNA-seq）能够从单个细胞分辨率下为人们展示细胞在各种环境下的状态以及功能，打破以往利用有限的细胞标记物对细胞异质性研究的局限性［4，5］。基于sc RNA-seq 的“人类细胞图谱”项目的开展也将加深对人体组织中处于不同分化或疾病状态细胞的理解［6］。这项技术在RA 的应用也为鉴定组织中浸润性免疫细胞亚群和致病性驻留细胞亚群，以及揭示疾病机制提供有力工具。本文将对sc RNA-seq 技术原理、常用的测序平台以及在RA中的研究进展进行综述。

1 单细胞转录组测序（sc RNA-seq）技术

sc RNA-seq 的一般流程包括单细胞悬液的制备、细胞捕获及裂解、逆转录及cDNA 扩增、文库构建及测序等，其中关键的两个步骤为细胞捕获与分子定量。细胞捕获最常用的方法是利用微孔、微流或者微滴的技术；而定量主要有基于全长或者标签两种方法：前者获取每个转录本覆盖度一致且独特的全长片段；后者则是通过标签探针，捕获RNA 的5’或3’端序列进行定性定量分析［7］。

2009年汤富酬团队首次报道了sc RNA-seq［8］，后又出现如Smart-seq2、MARS-seq、CEL-seq、Drop-seq、inDrop 和10X Chromium 等技术。其中Smartseq2 可得到全长的mRNA 序列，而MARS-seq、CEL-seq、Drop-seq、inDrop 和10X Chromium 是将标签整合到cDNA 中［9］。不同的方法在原理以及灵敏度上有所差异，故应该结合具体的生物学问题选择最适合的平台。而Smart-seq2 的主要优势在于可以得到的mRNA 全长信息［5，10］。

sc RNA-seq 数据在细胞层面的分析主要包括细胞聚类和细胞轨迹推测，前者通过降维、无监督聚类的算法对基因表达相似的细胞进行分群；而后者则是使用最小生成树的策略，对细胞进行排序，模拟出细胞的分化轨迹。在基因层面的分析主要包括分析差异基因表达、鉴定细胞标记、结合时间轨迹分析基因表达的变化情况、以及分析基因共表达模块和调控网络等［11］。此外，测序数据还可以结合单细胞甲基化、染色质的可及性以及表面蛋白等数据共同分析，为疾病机制研究提供更加全面的策略［12］。

2 常用测序平台

目前研究常用的平台包括基于微滴的in-Drop［13］、Drop-seq［14］、10x Genomics［15］、基于微孔的BD Rhapsody［16］等高通量平台，以及基于微流的C1 system（Fluidigm）［17］平台等。InDrop、Drop-seq 和10x Genomics 均将细胞与微球包裹在微液滴中，用微球上独特的条形码区分细胞。这些平台的主要差异在于条形码的使用数量和微球的物理特性，如Drop-seq 比inDrop 的条形码更多，可以处理更多的细胞，但缺点是细胞捕获效率低（约1%）。而in-Drop 和10x Genomics 平台的微球由水凝胶构成，捕获效率更高（前者约10%；后者约50%）［18］。10x Genomics 还可同时实现单细胞表面蛋白测定［19］和TCR/BCR 测序［20］。BD Rhapsody 平台在微孔中收集细胞，细胞溶解后释放的mRNA 与细胞标记结合，同时系统还使用UMI 序列标记mRNA，以减少扩增偏差；可以实现靶向测序，降低实验成本［9］；可以结合BD AbSeq assays 同时分析转录组和蛋白质，为细胞分群提供更可靠的依据［16］。C1 system（Fluidigm）则是将单个细胞分配到各自反应室，通过显微镜来区分细胞状态，计算捕获细胞的数量，然后对细胞进行裂解、RNA 逆转录和预扩增以及后续测序分析，其优势在于可以得到全长mRNA 的信息，但捕获细胞数量少、成本高且周期长［17］。

3 sc RNA-seq在类风湿关节炎研究中的应用

3.1 绘制滑膜组织细胞图谱

高通量sc RNA-seq 为细胞图谱的建立奠定了技术基础，已发表的来自小鼠和健康人群各种组织的细胞图谱也为进一步研究病理组织中的细胞提供了包括细胞标记物和细胞功能在内的理论依据［21-22］。随着sc RNA-seq 在RA 中的广泛应用，对滑膜细胞功能与状态的理解也更加深入。2018年，Stephenson 等［23］开发了一种低成本的微流控技术，对RA 患者膝关节滑膜组织中的细胞进行了Drop-Seq，利用无监督聚类的算法，结合细胞特异性标记物，将20387 个细胞细分成了包括3 种成纤维细胞、3 种T 细胞、NK 细胞等在内的13 个细胞亚群，首次展现出一个全面的滑膜组织细胞图谱。Zhang 等［24］利用流式细胞分选技术将CD4+T 细胞、B 细胞、单核细胞和成纤维细胞分选出来分别进行CEL-Seq2，并整合RNA-seq 得到的数据，确定并阐述了4 种成纤维细胞亚群、4 种单核细胞亚群、3 种CD4+T 细胞亚群、3 种CD8+T 细胞亚群和4 种B 细胞亚型的特征。研究者进一步对与疾病相关的基因如炎症反应和干扰素基因等在每群细胞的差异或公共表达进行了分析，为寻找疾病干预靶点提供了思路。

3.2 鉴定关键细胞亚群

在针对疾病不同特征如持续的炎症以及关节的破坏等发生机制的研究中，将sc RNA-seq 技术应用于关注的细胞群体也可以帮助研究者寻找靶向性更高的治疗方式。为了分析成纤维细胞的异质性，Mizoguchi 等［25］对RA 和骨关节炎（osteoarthritis，OA）患者滑膜组织的成纤维细胞进行了Smart-Seq2，结合表面蛋白的结果，确定了在RA 中显著扩增的成纤维细胞亚群。这群细胞定位在滑膜的血管周围，基因功能分析也揭示了其在免疫细胞募集和破骨细胞形成上的潜在作用。在针对巨噬细胞的研究中，Kuo 等［26］报道了HBEGF+炎症巨噬细胞，这群细胞显著表达促进炎症反应的基因NR4A3、PLAUR 和CXCL2，以 及 生 长 因 子HBEGF 和EREG，而对该群巨噬细胞-成纤维细胞作用轴的干扰也成为RA 治疗的新方向。Stephan 等［27］证实了分化的CX3CR1+巨噬细胞的存在，这群细胞表达Trem2 和Vsig4 等免疫基因，并可以在滑膜衬里形成一个内部免疫屏障，抑制关节的炎症反应。此外，为了鉴定出能够分化为破骨细胞的亚群，研究者分选了CX3CR1hiLy6Cint细胞，在BD Rhapsody 平台进行了测序，发现了由Foxm1 因子调节的具有破骨细胞特征的细胞群体，也证实了Foxm1 具有调控特定巨噬细胞向破骨细胞分化的作用［28］。

3.3 单细胞多组学应用

单细胞多组学测序可以通过优化和整合基因组、表观遗传、转录组和蛋白质组提供的不同数据，全面分析单个细胞的独特基因型、表型以及潜在的调控机制［29］。在RA 中，单细胞多组学的应用集中于转录组和蛋白组。在一项鉴定RA 中扩增CD4+T细胞克隆的定性和定量的特征的研究中，Ishigaki等［30］对RA 患者和健康人的外周血中的CD4+T 细胞进行了单细胞TCR 分析，并对外周血与滑膜中显著扩增的CD4+T 细胞克隆进行了sc RNA seq 分析，由此追踪同一克隆内基因表达的变化。此外，为了分析并验证更加稳定的细胞分群，转录组数据可以结合bulk RNA-seq 以及单细胞表面蛋白的数据。比如在鉴定RA 患者中驱动炎症的细胞亚群时，可以利用典型相关性分析算法整合bulk RNAseq 和sc RNA-seq 数据，同时应用质谱流式细胞技术进行分群与验证［24］。既往研究已经表明DNA 的甲基化和组蛋白修饰等是RA 发病的关键因素，因此未来对单细胞表观遗传和转录组的综合分析也将有助于理解RA 的调控机制［31］。

3.4 sc RNA-seq 数据挖掘

基于sc RNA-seq 的数据挖掘已经广泛应用于肿瘤的研究，帮助研究者发现新的思路或验证假说［32］。RA 的数据挖掘也已逐渐开展，Gawel 等［33］对关节炎小鼠模型的关节和淋巴结的sc RNA-seq 数据进行了系统性分析，发现信号通路、潜在的生物标记物以及药物靶点等在各种细胞类型中存在差异，并构建了疾病相关细胞类型和相互作用的网络模型，用于系统性地分析可靠的生物标记物和药物。在一项验证外周血与关节炎症反应存在差异的meta 分析中，研究者也补充了sc RNA-seq 的数据挖掘，发现了血液和关节中共存的4 种细胞群炎症反应表达谱的差异，为假设提供了更多的支持证据［34］。基于同样的思路，Lewis 等［35］完善了免疫途径在各种细胞亚群差异性激活的研究。进一步的分析提示WNT、TGF-β、FcεRI 以及ERBB 信号通路对成纤维细胞的转变起到调节作用，而这些变化的通路则可能为两种疾病的治疗提供方向［36］。

4 总结与展望

Sc RNA-seq 测序除了有助于鉴定细胞亚群，还可预测细胞在疾病进展中的分化状态。目前已经成功对不同阶段OA 患者的软骨细胞进行测序和拟时间轨迹分析，揭示了疾病不同阶段的基因表达谱变化，这提示在有关RA 的研究中也可以根据患者的不同发病阶段分析基因表达谱的改变，寻找可能的干预靶点［37］。此外单细胞空间转录组的出现也可以在不丢失细胞空间信息的前提下研究细胞与微环境的相互作用，识别不同细胞群在其空间背景下的特定功能［38］。因此，随着sc RNA-seq 技术的完善以及在RA 中的广泛应用对骨膜组织内的细胞状态的研究将更加深入。且结合单细胞多组学以及空间转录组的信息，可从基因、表观遗传、转录组、蛋白组以及组织微环境层面全面分析RA 的发病机制，为疾病分期、发现新的治疗靶点和确定疾病早期诊断标记物提供理论依据。