乙型肝炎病毒血清学标志物检测技术的发展历程

张学东 卢建华 王梦寒 戴二黑★

自从1965年美国巴鲁克·布伦博格博士（Baruch Blumberg）发现澳大利亚抗原即乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）以来，至今已有50 多年的历史［1］，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染的实验室检测方法不断涌现和更新换代，HBV DNA、HBV RNA、HBV cccDNA 定量检测、HBV 基因型与基因突变位点检测、HBV 核心相关抗原（HBcrAg）检测等新技术、新方法相继问世并在临床逐渐推广应用［2-6］。与此同时，传统的HBV 血清学标志物如常用的HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc 乙肝“两对半”等检测技术也不断创新发展［7］，从最初的免疫扩散技术相继建立了对流免疫电泳技术（CIEP）、红细胞凝集试验、放射免疫分析试验（Rodio Immunoassay，RIA）、酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）、固相膜免疫分析技术、化学发光免疫分析技术（chemiluminescent immunoassay，CLIA）等。

本文重点对以上HBV 血清学标志物检测技术的原理及其特点进行简要介绍，旨在帮助大家在正确地了解HBV 血清学标志物检测方法的基础上，根据各单位的实际情况科学合理的选用这些技术。

1 HBV 血清学标志物检测技术

1.1 对流免疫电泳技术

对流免疫电泳是将双向免疫扩散与电泳相结合，在直流电场中定向加速的免疫扩散技术。1970年，Gocke、prinee 等用对流免疫电泳技术检测乙型肝炎表面抗原（HBsAg）和表面抗体（HBsAb），取得了较好的效果而被推广应用［8］；中国学者余乾炎和张志荣也在HBsAg 上做了相应研究［9］。该试验相对简单、快速，灵敏度相比双向免疫扩散试验提高8～16 倍，可测定的蛋白质浓度最低限度达μg/mL 水平。该方法常用于抗原或抗体的性质、效价和纯度的测定，但不适用于抗原为免疫球蛋白或抗原抗体迁移率接近的情况，否则会导致抗原抗体朝同一个方向泳动［9］。目前随着新的检测技术的发展，乙肝血清学标志物检测目前很少应用此技术。

1.2 红细胞凝集试验

红细胞凝集试验利用抗人O 型红细胞的单克隆抗体，该抗体能与任何血型的红细胞结合而不出现凝集现象，将此抗体与特异性抗体或抗原连接，运用特异性凝集反应可检测标本中的抗原或抗体［10］。该试验中受检标本为新鲜全血，取手指血或耳垂血即可进行实验，受检者即刻可知检测结果。此试验以前曾经用于检测乙肝表面抗原，灵敏度为2～5 IU/mL，根据最新国家行业标准要求［11］，HBsAg要求检测限adr≤0.1 IU/mL，adw≤0.1 IU/mL，ay≤0.2 IU/mL，因此此技术灵敏度不能满足国家标准要求，乙肝血清学标志物检测一般不再使用此技术。

1.3 放射免疫分析试验

放射性免疫试验以放射性核素为基本特征，用放射性核素标记抗原或抗体分子，通过测定放射性强度评估抗原-抗体反应的情况，从而实现对待测物质的定量或定性分析［12］。放射免疫试验将放射性核素的高灵敏性与抗原-抗体间的高特异性结合于一体，检测HBsAg 灵敏度可以达到0.5 IU/mL。放射性免疫试验开创了体液微量物质定量分析的新纪元［13］，并为建立酶免疫试验、化学发光免疫试验等方法奠定了理论和实践基础。目前，由于放射性核素的放射性污染问题，放射免疫试验已经逐渐被酶免疫试验、化学发光免疫试验等方法所替代。

1.4 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验是以酶作为标记指示物，以抗原抗体免疫反应为基础的固相吸附测定方法。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性［14］。ELISA 技术因具有方法简单、易于操作、试剂开放、成本较低等优点，从上世纪80年代开始一直占据临床免疫学检测领域的主导地位，采用此技术检测乙肝血清学标志物乙肝“两对半”，如HBsAg 灵敏度可以达到0.1 IU/mL［15］。但是，因为存在手工操作误差大、耗费人力，结果报告时间久，灰区结果较多，难以准确定量，需要批量操作，以及灵敏度和特异性较低等劣势，人们一直在探寻新的方法克服ELISA 技术的不足。

1.5 固相膜免疫分析技术

固相膜免疫分析技术属于快速免疫检验技术，一般包括免疫层析试验、免疫渗虑试验、斑点酶联免疫吸附试验和免疫印迹试验。用于乙肝血清学标志物检测的技术主要是免疫层析试验，以硝酸纤维素膜等为固相载体，样品溶液借助毛细作用在层析条上泳动，同时样品中的待测物与层析材料上待测物的受体发生高特异性、高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域，通过目测或仪器检测标记物聚集而得到直观的实验结果。这项技术多用于急诊检测及床旁检测，但由于其检测HBsAg 的灵敏度只有5 IU/mL［16］，人眼判断结果主观性较强，批量化操作相对较难等问题，在应用范围方面受到一定的限制。

1.6 化学发光免疫分析技术

化学发光免疫分析技术是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象，由于化学反应产生电子能级处于激发态的物质，被激发的物质通过跃迁释放能量产生光子，从而导致发光现象。按发光持续时间分为辉光型（glow）和闪光型（flash），辉光型发光时间在数分钟至数十分钟以上；闪光型发光时间在数秒内［17］。

1.6.1 化学发光技术分类及代表性厂家

化学发光检测技术大体上可分为两大类，即酶促与非酶促化学发光免疫检测系统。酶促化学发光免疫检测系统中作为标记物的酶基本不被消耗，而反应体系中发光剂的量充分过量，发光强度稳定，发光时间长，常采用速率法检测［18］。其中辣根过氧化物酶系统的标记物为辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP），以鲁米诺（Luminol）及其衍生物作为发光底物［19］，安图、强生等厂家的化学发光检测系统属于此类；碱性磷酸酶系统的标记物为碱性磷酸酶（AP），以螺旋金刚烷环氧化物苯磷酸酯（3-［2-spiroadamatane］-4-methoxy-4-［3-phosphoryloxy］-phenyl-1，2-dioxetane）Dioxetane，AMPPD）作为发光底物［20］，迈瑞、西门子（德普）、希斯美康、贝克曼等厂家的化学发光检测系统属于此类。非酶促化学发光检测系统目前有三种方法，一是直接化学发光，作为标记物的化学物质如吖啶酯在碱性环境下，直接被过氧化物氧化产生发光信号，发光过程中标记物被消耗，发光信号持续时间短，检测模块需加装进样器［21］，雅培、西门子等厂家的化学发光检测系统属于此类。二是通过电极上的电化学反应产生而不是由氧化剂或者发光剂产生，标记物为三联吡啶钌衍生物即［Ru（bpy）3］2+，并以三丙胺为还原剂［22］，该技术是罗氏公司的专利。三是光激化学发光（LiCA）：如目标抗原可使两个抗体上标记的感光珠和发光珠紧密的连接在一起，在680 nm 激发光下，可完成鲁米诺氧化途径化学发光过程［23］，国内科美公司的化学发光检测系统属于此类。

1.6.2 磁微粒化学发光检测系统特点及乙肝标志物应用

由于磁微粒本身具有大比表面和高分散稳定性、超顺磁性生物相容性、功能基特性、生物活性物质化学连接、类均相反应等特性［24］，赋予磁微粒化学发光检测系统以下几方面的特点：①灵敏度高，如采用鲁米诺系统的化学发光法，检测发光值的信号范围0～10 亿［25］。②反应迅速：属于类均相反应，底物不需要终止直接发光，整体反应时间在17～56 min。③随机单孔管理：具有样本随到随测或急诊功能，不存在加样时间差。④自动化程度高：磁微粒化学发光分析仪集自动进样、加样、反应、检测、打印报告等步骤于一体。⑤全封闭系统：磁微粒化学发光分析仪整个系统封闭，避免了人为因素带来的检测误差，同时也提高了生物安全性。

化学发光免疫检测技术由于上述各方面性能的优势，促进了乙肝血清学标志物由定性检测向定量检测转变［26］。目前国内外主流产品可进行表面抗原和表面抗体的定量检测，单位分别为IU/mL 和mIU/mL。而安图生物率先在国际上研发和生产了基于磁微粒化学发光检测技术的乙肝五项全定量全自动检测系统，表面抗原和表面抗体均可以溯源至WHO 和国家标准物质；e 抗原、e 抗体、核心抗体也可以溯源至WHO 标准物质。乙肝五项全定量检测赋予了乙肝血清学标志物新的内涵和临床意义［27］，为深入研究乙肝自然史、抗病毒治疗疗效预测与监测、乙肝疫苗免疫效果评价、推动精准医疗等提供了坚实可靠的平台。

2 小结与展望

近年来，化学发光免疫分析方法及应用研究发展异常迅速，并以其独特的优势在乙肝检测领域得到了广泛应用，特别是磁性微粒子的免疫分离技术、金纳米粒子的催化功能以及化学发光共振能量转移在化学发光免疫分析方法中的应用［28］。但是，化学发光免疫分析技术在实际应用中仍然存在不足，如核心技术智能化控制技术欠缺等［29］。为了使化学发光免疫分析技术得到更加广泛的应用，未来研究的主要方向应集中在以下几个方面：①分析仪器的大通量化与流水线化；②降低仪器成本，使仪器微型化、便携化；③强化对检测样本基质的处理，减少非特异性吸附，提高检测的稳定性；④在高通量研究方面，完善多通道、多组分化学发光免疫分析检测技术，提高检测效率；⑤发展化学发光免疫分析联用技术，扩大应用范围。

化学发光经过近30年发展已成为临床主要检测技术之一。随着检验分析技术的不断进步，实验室和临床检验仪器从过去半自动化逐步向全自动化普及［30］，工作模式也从过去单台仪器的自动工作发展到目前流水线作业的全实验室自动化（Total laboratory automation，TLA）或称为全程自动化，流水线和生化免疫联机是大势所趋。国产化学发光乙肝产品在新形势下有着巨大的市场潜力，同时也将面临着更加激烈、残酷的竞争。如何提高检测精准度、检测稳定性等方面或许是化学发光乙肝产品保持竞争力的核心问题。这也需要行业内所有的企业的共同努力，在竞争中成长、在成长中优化，促进化学发光技术的长远发展。

乙肝检测技术从定性到定量的发展，需要解决溯源准确性的问题。化学发光技术面临当前及未来医学发展的需求，在辅助临床诊断之外，承担起更多疾病的早期筛查、治疗效果监测及预后评估等任务时，就不得不要求更准确更科学的检测结果。乙肝化学发光产品由定性向定量的功能升级转换也对企业提出的更高要求。检验结果的溯源性将成为检验仪器、试剂生产以及临床实验室检验的重要质量指标，也必然受到IVD 厂商和医学实验室越来越多的重视。