趋化因子配体16在非小细胞肺癌中的表达

郑 瑞，浦 春

(皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 检验科，安徽 芜湖 241001)

进入21世纪以来，肺癌已成为我国病死率最高的恶性肿瘤。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌的主要形式，占原发性肺癌的82%～87%，属最常见的组织学类型[1]。大多数NSCLC患者在诊断时就已经是晚期或伴有合并症而不能行根治性手术。因此筛选肺癌特异性的蛋白对于肺癌患者实现早诊断、早治疗有重要意义。趋化因子配体16(C-X-C chemokine ligand 16，CXCL16)是氧化低密度脂蛋白的清道夫受体，有跨膜型和可溶解型两种形式[2]。CXCL16对不同类型人类癌症都有影响，如乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌等[3-5]。激活CXCL16/CXCR6可导致乳腺癌和前列腺癌的进展[6-7]。Liang等对生存曲线的分析提示，肺癌组织中CXCL16高表达，患者总体生存率降低，因此它可能是影响肺癌患者预后的消极因素[8]。本研究通过检测人肺腺癌细胞株和NSCLC患者组织和血清中CXCL16的表达，分析其与临床病理参数的相关性，探讨CXCL16在NSCLC中的表达及临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究共使用4种人类肺腺癌细胞株(A549、 H1299、H460、H446)及人正常肺上皮细胞株(B2B)。选取 2018年9月～2019年5月在弋矶山医院就诊的NSCLC患者50例，收集患者的石蜡组织标本和外周血血清，同时选取40例健康体检者外周血血清。50例NSCLC患者的平均年龄为(60±8.28)岁，40例健康体检者年龄为(58±7.50)岁。所有患者的确诊均经术后病理检查，且术前未接受放、化疗或其他治疗。

1.2 试剂和原理 细胞株CXCL16的检测使用CXCL16一抗体(abcam,ab101404)，购于美国Abcam Ltd公司，原理是蛋白质印迹法。组织CXCL16的检测使用兔抗人CXCL16抗体(13902-1-AP)，购自Affinity公司，原理是免疫组织化学染色。其他试剂和材料主要有二甲苯、梯度乙醇、 3% 过氧化氢、 1% 盐酸乙醇、苏木精等。血清CXCL16的检测采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验，试剂盒购于苏州卡尔文生物科技有限公司。

1.3 方法及结果判断 WB 检测 CXCL16蛋白的表达：提取细胞株中的CXCL16蛋白，以 90V 恒压模式进行电泳，在350 mA、 70 min 恒流模式进行转膜，免疫反应后使用Bio-Rad成像系统和ECL试剂盒进行检测，分析条带的灰度值。组织标本按照免疫组化试剂盒说明书进行制片，镜下观察。CXCL16阳性表达表现为细胞质和细胞膜呈黄色或棕黄色颗粒。免疫组化评分依据阳性染色细胞的百分比及染色的强度计算，结果评判如下：<2，阴性表达(-)；≥2，阳性表达； 2～3，低表达(+)；4～7，高表达(++～+++)。所有血清标本的采集都获得研究对象知情同意。抽取外周静脉血4 mL，静置30 min离心，留取血清用于检测。以标准品浓度作横坐标，对应OD 值作纵坐标，绘制标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各血清样本CXCL16浓度值。

2 结果

2.1 CXCL16在人肺腺癌细胞株和人正常肺上皮细胞株的表达 WB检测显示，CXCL16在人正常肺上皮细胞B2B和肺腺癌细胞系A549、H1299、H460、H446中均有表达，且相比于B2B细胞，4种肺癌细胞株中CXCL16的表达水平上调；与内参蛋白β-actin相比，肺癌细胞株(A549、 H1299、H460、H446)也高于正常肺上皮细胞株(B2B)(P<0.05，见图1、2)。

图1 CXCL16在肺腺癌细胞株与正常肺上皮细胞株的表达

F46.218，P0.000，与B2B比较，*P<0.05，** P<0.001。

2.2 CXCL16 在NSCLC组织及癌旁组织中的表达 免疫组化结果显示，NSCLC组织和癌旁组织细胞均可见CXCL16的阳性表达，表现为细胞质和细胞膜中呈棕黄色或者棕褐色(见图3)。NSCLC组织中CXCL16表达[84.0%(42/50)]高于癌旁组织[44.0%(22/50)]，差异有统计学意义(χ2=17.361，P=0.000)。

图3 CXCL16在NSCLC组织和癌旁组织中的表达

2.3 NSCLC组织中CXCL16的表达与临床参数的相关性 50例NSCLC标本中，CXCL16均呈阳性表达，其表达与性别、年龄、组织学分类、淋巴结转移、TNM分期、胸膜转移及分化程度等差异均无统计学意义(P>0.05，见表1)。

2.4 CXCL16在NSCLC组和对照组血清中的表达 NSCLC患者组血清CXCL16表达水平[(1761.28±323.58)pg/mL]高于对照组[(1035.25±201.26)pg/mL]，差异有统计学意义(t=12.34，P=0.000 )(见图4)。

2.5 血清CXCL16与NSCLC组织表达的相关性 将组织中表达的免疫组化评分作为半定量值与血清中CXCL16的浓度值进行Spearman相关性分析。结果显示，血清与组织中CXCL16表达相关性无统计学意义(rs=0.032，P=0.826)。

表1 CXCL16在NSCLC组织中的表达与临床参数资料的关系

图4 CXCL16在NSCLC组和对照组血清中的表达

3 讨论

我国肺癌的发病率和病死率非常接近，5年生存率低，NSCLC是肺癌最常见的组织学类型[1]。CXCL16 属于趋化因子超家族成员之一，与其受体CXCR6的相互作用会促进肿瘤血管生成，促进肿瘤增殖和转移[2]。2007年，Hojo等提出CXCL16高表达是结直肠癌的阳性预后因子[9]。Hald[10]报道发现CXCL16在基质细胞高表达和基质细胞与癌细胞联合高表达是NSCLC独立的阳性预后因素。这些提示CXCL16可能在肿瘤的发生和转移中起重要作用，其表达情况有望为癌症患者预测及临床治疗提供参考价值。

Hu等[11]发现CXCL16在人肺癌组织中高表达，也证明了CXCL16、CXCR6信号通路的激活可以促进肺癌细胞的侵袭。本研究通过检测CXCL16在4种肺腺癌细胞株和人正常肺上皮细胞株的表达，发现CXCL16在肺腺癌细胞株中的表达明显高于正常肺上皮细胞株，提示CXCL16/CXCR6轴在肺癌的发生发展机制中可能有某些生物学意义。

Wagsater等发现CXCL16在多种癌症组织中表达失调[5，12]。我们的研究显示CXCL16在NSCLC组织中呈阳性表达，且癌组织的表达较癌旁组织上调(P<0.01)，这与Kee[5]的结论一致。但Hald等[10]在对NSCLC的研究时发现癌组织中的CXCL16为低表达，敲除CXCL16时观察到肿瘤增殖增加，与我们的结论不一致。CXCL16在NSCLC组织的表达与性别、年龄、组织学分型、TNM分期、有无淋巴结和胸膜转移差异均无统计学意义(P>0.05)，这与文献报道[5]的淋巴结转移组CXCL16的表达明显高于相应的非转移组不一致。可能与所选病例类型单一和样本量少有关，同时也决定了我们接下来的研究方向：适宜的扩大样本规模，增加基因检测等手段进一步探索CXCL16的表达机制，为NSCLC的预测提供新的思路。

CXCL16可以稳定存在于血清中，在NSCLC的血清中检测出高水平的CXCL16尤其重要。张珺等[13]发现，NSCLC患者血清中CXCL16高表达且与TNM分期有关，可能是预测NSCLC转移预后的指标。我们检测了血清CXCL16的表达，结果提示， NSCLC组的表达比对照组上调(P<0.05)，与之前的研究一致。我们将组织与血清中CXCL16的表达进行了相关性分析，发现两者无明显相关性。这可能是由于血清中CXCL16水平主要反映可溶性的CXCL16，但可溶性CXCL16的水平可能不能代表肺中跨膜型CXCL16的水平。另外本研究的样本量小，前期研究对象的选择有偏移也会造成研究结果的偏差。

综上所述，CXCL16在肺腺癌细胞系和NSCLC的组织中均高表达，同时血清中NSCLC组的表达较对照组也明显上调，但血清CXCL16对NSCLC的临床价值仍有待商榷，研究也有待进一步扩大样本量，同时检测组织中 CXCL16的mRNA水平，更深一步的论证本研究结果的可靠性， CXCL16对于NSCLC的作用机制也有待进一步研究。