恶性胸腔积液巨噬细胞CD163、ANGPTL4表达及相关性研究

秦立龙，臧蕾蕾，全 斌，牛永亮，刘 伟，潘玲玲，孙珍贵

(皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 呼吸内科，安徽 芜湖 241001)

恶性胸腔积液(malignant pleural effusion，MPE)是肺癌常见的并发症，15%肺癌患者初诊时合并MPE，50%患者在疾病过程中产生MPE[1]。传统观点将MPE归因于肿瘤细胞转移至胸膜或纵膈淋巴结引起胸水生成与重吸收失衡，但新的观点认为血管生成、血管通透性增强或炎症反应促进MPE形成[2]，而宿主细胞与肿瘤细胞复杂的交互作用增强血管生成、血管渗漏、炎症和癌细胞侵袭。虽然宿主免疫细胞如间皮细胞和淋巴细胞在MPE形成中的功能作用还有待确定，但巨噬细胞的重要性不断得到重视。

巨噬细胞是胸水细胞的重要组成成分，占所有细胞一半以上。胸腔巨噬细胞衍自通过胸膜间皮衬层迁移的外周血单核细胞，MPE发生过程中巨噬细胞被认为在胸水积聚，分泌细胞因子参与炎症和纤维化反应。巨噬细胞呈现两种表型：经典激活型(M1)和替代活化型(M2)。M1巨噬细胞表达促炎分子、触发Th1免疫反应，作为炎症应答及抗肿瘤免疫的重要细胞成分；M2主要表达抗炎分子和趋化因子，激活Th2免疫反应；通过促进血管生成、基质重塑和抑制适应性免疫促进肿瘤的发生和发展。M1缺乏可靠的表面标记物，M2表面受体包括血红蛋白清道夫受体(hemoglobin scavenger receptor，CD163)、甘露糖受体CD206(mannose receptor 206)和C型凝集素受体等，其中CD163仅限于单核细胞/巨噬细胞谱系，为M2巨噬细胞的一个特异性标记物[3-4]，部分研究将免疫组化鉴定的CD163+细胞作为M2巨噬细胞[5]。CD163由抗炎信号如糖皮质激素和某些细胞因子(IL-6和IL-10)激活。研究表明，来自非恶性胸腔积液的巨噬细胞呈现M1表型，而MPE巨噬细胞呈现非经典性M2表型[6]。MPE中CD163+巨噬细胞比例及在MPE促血管生成因子生成中的重要性仍不清楚。

血管生成和血管通透性增加有助于肿瘤转移，血管生成素样蛋白4(angiogenin-like protein 4，ANGPTL4)是血管生成素家族成员之一，也称为过氧化物酶体增殖活化受体PPAR γ诱导的血管生成素相关蛋白，调节血管通透性、血管生成和炎症反应[7]。ANGPTL4在转移性肿瘤中高表达，表明它可能在转移过程中起重要的作用；但研究也发现ANGPTL4抑制血管渗漏防止转移，说明ANGPTL4功能可能受肿瘤微环境影响并具组织特异性。ANGPTL4也可以是癌症诊断的潜在生物标志物。

本研究通过免疫组化技术分析巨噬细胞CD163、ANGPTL4表达及胸水中ANGPTL4水平，评估CD163+巨噬细胞与ANGPTL4的相关性，探讨CD163+巨噬细胞在肺癌MPE发病中的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择2014年1月～2015年11月在弋矶山医院呼吸内科住院确诊的肺癌伴MPE患者40例，其中男15例，女性25例，平均年龄(58.08±8.04)岁；包括肺鳞癌5例，肺腺癌30例，小细胞肺癌5例。结核性胸腔积液(tuberculous pleural effusion，TPE)患者20例，其中男女各10例，平均年龄(40.75±16.04)岁。所有患者均签署知情同意书。

肺癌MPE的诊断基于胸腔积液中找到癌细胞和(或)胸膜活检标本病理学确诊为原发性肺癌并排除任何其他转移性癌引起的胸腔积液。TPE的诊断依据患者临床病史、胸水腺苷脱氨酶(ADA)≥40 U/L，同时胸膜活检标本显示干酪样肉芽肿。

1.2 胸水收集和处理 留取患者入院后首次胸穿获得的胸水约100～500 mL，3 000 r/min离心20 min，细胞沉淀制作成蜡块，收集上清液10 mL等分储存于-80℃冰箱，待检ANGPTL4。

1.3 CD163、ANGPTL4免疫组化检测 将新鲜胸水标本以10%福尔马林固定、石蜡包埋，制成4 μm组织切片。链霉素抗生物素-过氧化物酶连接法进行免疫组化检测。分别滴加鼠抗人CD163单克隆抗体(1∶150)(北京中杉金桥公司)、鼠抗人ANGPTL4多克隆抗体(1∶150)(北京博奥森公司)，PV-6000山羊抗鼠IgG/HRP聚合物(北京中杉金桥公司)。DAB显色、苏木精复染。釆用双盲法判定免疫组化结果：先在100倍光镜下选取4个视野较好的区域，后在400倍光镜下随机选择5个高倍视野(HPF)计数阳性细胞数，取其平均值，分别以CD163、ANGPTL4+巨噬细胞平均数除以巨噬细胞总数计算CD163、ANGPTL4+巨噬细胞百分比。

1.4 ELISA检测胸水中ANGPTL4浓度 ELISA法检测ANGPTL4浓度，操作步骤按试剂盒(武汉华美生物工程有限公司)说明书进行， ANGPTL4检测浓度是0.39 ng/mL。

1.5 统计学分析 采用SPSS 18.0统计软件进行统计分析。MPE组与TPE组CD163+细胞数、ANGPTL浓度采用中位数表示，组间比较采用秩和检验，双变量相关性采用Spearman相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD163在MPE、TPE巨噬细胞表达及阳性细胞百分比比较 400倍光镜下结合CD163染色和细胞形态鉴定CD163+和CD163-巨噬细胞，CD163表达定位于胞质或胞膜，呈黄褐色至棕黄色颗粒状。MPE组CD163+巨噬细胞中位数97.32%(86%、126%)多于TPE组的26.41%(16.5%、33.5%)，差异有统计学意义(Z=6.276，P=0.000)。见图1。

2.2 MPE和TPE胸水中ANGPTL4水平 ELISA检测胸水中ANGPTL4浓度，MPE组ANGPTL4浓度中位数40.50 ng/mL(26.64 ng/mL、101.75 ng/mL)高于TPE组的27.25 ng/mL(19.51 ng/mL、50.67 ng/mL)，差异有统计学意义(Z=2.682，P=0.007)。

2.3 ANGPTL4在MPE及TPE中巨噬细胞的表达 MPE多种细胞如巨噬细胞、间皮细胞、肿瘤细胞胞质或胞膜均表达ANPTL4，呈黄褐色至棕黄色颗粒状，所有巨噬细胞均呈阳性；TPE部分巨噬细胞表达ANGPTL4(图2)，阳性细胞占(76.50±14.37)%。

A.MPE；b.TPE。

A.MPE；b.TPE。

2.4 MPE中CD163+巨噬细胞数量与胸水上清液中ANGPTL4浓度相关性 对MPE中CD163+巨噬细胞数与ANGPTL4浓度的关系进行秩相关分析，结果显示， CD163+巨噬细胞数与ANGPTL4浓度存在相关关系(rs=0.912，P=0.000)。

3 讨论

胸腔积液巨噬细胞是研究免疫细胞和肿瘤细胞相互作用的一种重要成分，已证明来自恶性胸腔积液的巨噬细胞自然杀伤活性和杀死肿瘤细胞能力削弱。M2巨噬细胞在癌症发生、发展中发挥重要作用，CD163为M2c巨噬细胞的特异性标记物[3]。既往采用流式细胞仪研究MPE中巨噬细胞分类，发现恶性胸水中巨噬细胞以非经典性M2型为主[6]。本研究着重于观察胸腔积液微环境中CD163+巨噬细胞比例及ANGPTL4的表达，将胸腔积液离心沉淀制成蜡块，采用免疫组化技术检测巨噬细胞CD163的表达，观察到相对于TPE，肺癌MPE中巨噬细胞数量和胞膜及胞质CD163染色强阳性的巨噬细胞百分比更高，此与以往研究结果基本一致，提示CD163+巨噬细胞在MPE发生发展中可能具有重要作用，更多的CD163+巨噬细胞有利于肿瘤细胞免疫逃逸，新生血管形成，而MPE微环境多种介质有利于巨噬细胞表型分化，促进MPE发展。我们认为巨噬细胞数量和百分比提供不同的信息和含义：MPE较TPE巨噬细胞细胞数量增多，这可能源于循环单核细胞更多的募集和分化；而百分比更好地反映分化过程中的环境，CD163+巨噬细胞也可能成为鉴别良恶性胸腔积液的指标之一。此外，本研究中我们对CD163+巨噬细胞的形态观察发现多种CD163表达强阳性的细胞融合，提示MPE中巨噬细胞与肿瘤细胞可能发生异型细胞融合。

肿瘤微环境丰富的IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β1等有利于M2型巨噬细胞极化，M2(M2c)巨噬细胞也分泌抗炎介质如IL-10[5]。从另一方面证明CD163+巨噬细胞为M2型巨噬细胞，增多的IL-10促进血管生成和抗细胞凋亡从而增加肺肿瘤细胞系的转移潜能。

血管生成是实体瘤生长和转移获取养分的重要条件，ANGPTL4是一种新型分泌糖蛋白，可以促进血管生成、肿瘤发生、肿瘤侵袭、抗失巢凋亡[8]，其功能作用取决于组织环境和转录后修饰状态。本研究发现MPE中多种细胞如巨噬细胞、癌细胞、间皮细胞表达ANGPTL4，所有的巨噬细胞均为ANGPTL4阳性，同时上清液中ANGPTL4蛋白表达量也明显高于TPE；相关分析示MPE中ANGPTL4表达水平与CD163+巨噬细胞数量显著正相关，提示MPE中ANGPTL4部分可能分泌自CD163+巨噬细胞，对MPE形成产生重要影响，巨噬细胞分泌ANGPTL4并释放到MPE中，增加胸膜毛细血管通透性并便于癌细胞播散；恶性胸腔积液微环境中ANGPTL4表达增加也可能参与巨噬细胞极化类型的调节。MPE中ANGPTL4的上调与MPE缺氧微环境缺氧诱导因子1α有密切关系[8]。

本研究局限性在于仅观察了CD163，而对M2巨噬细胞其他标志物及M1巨噬细胞标志物均未检测，因此可能会导致结论过于简单化；使用免疫细胞化学法分析属半定量测量，也可能导致不正确的解释。此外，本研究收集的样本例数偏小，可能引起结果产生一定的偏差。总之，CD163+巨噬细胞在肺癌MPE发生中的作用、是否与预后相关，有待进一步观察研究。