microRNAs调控干细胞血管向分化的研究进展

张 青，陈 婷

(浙江大学医学院附属第一医院 心血管内科， 浙江 杭州 310003)

随着人们生活方式的改变及老龄化社会的步入，心脑血管疾病发病率呈持续上升趋势，占我国每年总死亡病因的50%以上，位于全球疾病负担前列。动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是其主要发病基础，包括血管内膜损伤、血管壁病理性重构及管腔狭窄过程。目前对这类疾病的处理策略主要包括改善生活方式、药物治疗及血运重建，但发病率及致死率仍居高不下，进一步探究其发病机制、调控因素及治疗靶点是非常必要的。

血管内皮细胞(endothelial cells，ECs)和血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)作为血管壁的主要组成部分，在AS病理过程中发挥着重要作用。既往认为损伤修复所需的ECs和VSMCs主要来自于原位血管壁细胞的过度增殖和表型转化。随着干细胞研究领域的兴起，发现来源于骨髓、外周血的循环干细胞和来源于血管壁的原位干细胞也能分化为ECs/VSMCs参与血管的损伤修复和病理性重塑。很多因子(物理性损伤、平滑肌细胞收缩激动剂、细胞外基质、神经内分泌因子、转化生长因子及Notch家族等)逐渐被证明参与干细胞分化的调控，但对于调控血管壁干细胞定向、单一地分化为ECs/VSMCs的分子机制却知之甚少。随着人类基因组测序的完成，发现既往被称为“转录噪音”的非编码 RNA 能在多个层面调控基因表达，其中研究最为广泛的miRs在干细胞血管向分化中的调控作用也逐渐被众多研究所证实。为进一步探索血管增生性疾病的发病机制及治疗靶点，在不同分化模型上对miRs调控干细胞向ECs/VSMCs分化的作用及机制进行总结是非常必要的。

1 miRs的简介

自1993年第一个miR lin4发现以来，一直被视为“转录垃圾”的miRs逐渐被人们认识。miR是一段长度为19～25 nt的内源性非编码RNA序列，在进化上高度保守，不参与编码蛋白质， 通过调控基因表达调节细胞分化、增殖、死亡和代谢[1]。目前已在人类发现约1000种miRs，参与调控90%以上的基因表达。miRs可以来自基因非编码区，也可以来自编码区，在细胞核中，miRs来源基因被RNA聚合酶II转录为初级microRNAs(primary microRNAs，pri-miRs)，在Drosha-DGCR8复合物的作用下，pri-miRs被切割成70～120 nt的发夹样前体microRNA(precursor-microRNAs，pre-miRs)，pre-miRs 被核输出蛋白exportin5 转运至细胞质，在Dicer-1酶的作用下切割成长度为19～25 nt的成熟双链RNA。双链RNA分开后，在5'端具有不稳定碱基配对的RNA链通常充当引导链，参与构成miRs的诱导沉默复合体(microRNA-induced silencing complex，RISC), 另一条RNA链一般被降解，少数情况下可以与AGO蛋白结合形成功能性miRs[2]。

miRs对靶基因的调控主要集中在转录后水平，比较公认的调节机制是通过靶向mRNA的3'端非编码区(untranslated regions, UTR)诱导其降解或翻译抑制。miRs 5'端的种子序列在进化上高度保守，通过碱基配对于 mRNA 的3'UTR端介导靶基因的识别和调控，另有研究报道miRs 3'端也具备识别、靶向及调控靶基因功能[3]。目前很多miRs的靶基因验证实验都证明miRs主要是通过靶向mRNA的3'UTR端发挥作用，但这些实验都存在一个不可忽略的靶基因筛选检测缺陷----只考虑3'UTR端而不是整段mRNA序列，其实早在2007年就有研究证明在mRNA的5'UTR端也存在miRs的作用位点，甚至发现miRs可同时作用于靶基因mRNA的3'UTR端和5'UTR端[4]。miRs是通过诱导mRNA降解还是翻译抑制主要取决于和靶基因mRNA之间的配对程度，完全配对通常诱导mRNA裂解，不完全配对往往诱导翻译抑制。但发现在不完全配对时也存在mRNA降解，而完全配对时也可诱导翻译抑制[5]。miRs对基因的调控机制是一个复杂的网络系统，即同一个miR可作用于不同靶基因，同一个靶基因也可同时受到多个miRs的靶向调控，甚至一个miR还可以通过多个靶位点协同作用于同一个靶基因，为其解释错综复杂的生物现象奠定了基础。

2 ECs与心血管疾病

2.1 ECs的特点 不同器官系统的ECs具有各自的形态和功能，在不同动脉甚至同一动脉的不同节段也存在差异。ECs呈多边形，厚度0.1～1 μm, 表达血管内皮细胞钙黏蛋白(vascular endothelial cadherin, VE-cadherin)、血小板内皮细胞黏附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1, Pecam-1)、 酪氨酸激酶免疫球蛋白样和表皮细胞生长因子(EGF)样域1 (tyrosine kinase with immunoglobulin-like and EGF-like domains 1, Tie-1)、酪氨酸激酶免疫球蛋白样和EGF 样域2(tyrosine kinase with immunoglobulin-like and EGF-like domains 2, Tie-2)、血管内皮生长因子受体1(vascular endothelial growth factor receptor-1, VEGFR1)和血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor-2, VEGFR2)等分子标志物，单层铺在血管树最内层构成血管内膜，是脉管系统的主要组成部分。相对于构成心血管系统的其他细胞而言，ECs较耐缺氧而不耐低温，亚低温治疗需考虑内皮损伤。成人血管内膜约含有1×1013～6×1013个ECs，主要功能包括抗栓、止血、成血管、免疫调节和血管张力调节。生理状态下完整的ECs发挥抗凝抗栓作用维持血液的流动状态，而血管内膜受损时ECs又能发挥止血作用阻止血液的丢失；ECs的血管生成功能不仅存在于胚胎发育阶段，也存在于出生后的生长发育和损伤修复过程，缺氧环境下产生的大量血管内皮生长因子(VEGF)激活ECs从血管内膜向外迁移形成新生血管[6]；ECs是血液和血管壁及组织之间的机械屏障，也是免疫屏障，参与炎症因子的分泌和炎症细胞的募集；ECs通过合成舒血管物质(前列环素、一氧化氮、内皮源性舒张因子)和缩血管物质(内皮素、血管紧张素Ⅱ、血管内皮收缩因子)旁分泌靶向VSMCs调节血管张力，目前甚至有研究者把内皮依赖性舒张功能障碍视为ECs受损的标志。随着1997年内皮祖细胞被首次鉴定，越来越多的研究发现外周循坏和血管壁来源的内皮祖细胞能够分化为健康的功能性ECs替代受损ECs，维持血管完整性[7]。

2.2 ECs与血管损伤修复 ECs附在血管壁最内层，结构或功能异常通常早于临床可检测疾病，是血管损伤修复的重要参与者。血管损伤起始阶段，ECs被激活，在结构上发生萎缩致血管通透性增加，在功能上发生紊乱致血小板反应性增加、黏附因子和组织因子表达增加及血栓调节蛋白减少，利于血栓形成。ECs损伤是血管损伤的始动信号，但在新型标记物内皮微粒概念提出之前，ECs损伤很难通过无创措施监测。血管损伤的修复起始于ECs增生完成的再内皮化，生理情况下，ECs的更新主要靠血管壁原有ECs的复制完成，病理条件下，再内皮化的细胞来源目前仍存在较大争议，有研究认为来源于血管壁和骨髓的内皮祖细胞均能分化为ECs参与再内皮化，也有研究认为后者不参与其中[8]。支架植入诱发的血管损伤修复中，ECs扮演着更为复杂的角色：支架植入在直接导致ECs损伤和脱落的同时还导致再内皮化生理性黏附面的丢失以及利于ECs附着的层流式血流被打乱，不利于ECs附着，影响再内皮化。随着药物洗脱支架的问世，支架药物相关内皮损伤也随之出现，目前也有通过释放生长因子或安装内皮祖细胞捕获装置促进支架植入后内皮修复的相关探索。

2.3 ECs与心血管疾病 ECs作为血液和组织屏障的第一道防线，参与很多心血管疾病的病理过程。在AS的两种发生学说(“脂质浸润”和“内皮损伤”)中，ECs损伤都被当作其早期标志物，远早于临床超声检测的斑块和经皮冠状动脉造影检测的狭窄。研究发现在轻度冠状动脉病变患者中存在动脉矛盾收缩，在仅有冠心病危险因素暴露患者中存在内皮功能失调，在高胆固醇血症载脂蛋白E(apoE)敲除小鼠模型上系统性输注内皮祖细胞可延缓AS的发生，甚至有研究发现冠心病危险因素数目可作为血管内皮功能障碍的有效独立预测因子[9]，这些事实均证明ECs功能损伤发生于AS的早期阶段。ECs还与高血压和心肌缺血梗死相关。在高血压病理过程中，硬化血管ECs的一氧化氮合成量明显减少，内皮依赖性的血管舒张功能减退，收缩功能亢进，导致血压升高。ECs在心肌缺血梗死中同时扮演受害者和元凶的角色，心肌梗死后，参与形成侧支血管的ECs发生损伤水肿，上调黏附分子表达，吸附炎症细胞，甚至诱发血栓，进一步造成自身损伤，舒血管物质分泌减少，加重心肌缺血，形成恶性循环，甚至有研究发现在运动性心肌缺血中就已经存在ECs功能受损[10]。

3 VSMCs与心血管疾病

3.1 VSMCs的特点 VSMCs起源于中胚层，正常情况下呈梭形，位于血管壁中膜，通过协调的舒张和收缩维持血压的动态平衡和调节血流的合理分布；VSMCs属于已分化细胞，表达特异性分子标志物平滑肌α-肌动蛋白(smooth muscle α-actin，SMαA)、平滑肌-22α(smooth muscle -22α，SM22α)、平滑肌肌球蛋白重链(smooth muscle myosin heavy chain，SMMHC)和h1-钙调蛋白(h1-caponin)，但除SMMHC之外均不能单独用来鉴定分化表型的VSMCs。成熟VSMCs并不是终末分化细胞，具有可塑性，存在不同的细胞表型并受到所处环境因素的控制[11]。生理情况下VSMCs在血清反应因子(serum response factor，SRF)、心肌素(myocardin，MYO)及miR-143/miR-145的作用下主要表现为收缩表型[12]。发生损伤时，VSMCs可转化为迁移增殖表型，收缩相关蛋白表达下降，舒缩功能受损，而去分化型特异性分子标志物胚胎肌动蛋白重链(embryonic form of smooth muscle myosin heavy chain，SMemb)和原肌球蛋白4(tropomyosin 4，TM4)表达上调，迁移、增殖及分泌能力明显增强。VSMCs的表型转化是为了适应和修复损伤，但不受控制的过度表型转化却可加速AS和支架后再狭窄等病变过程。

3.2 VSMCs与血管损伤修复 血管损伤修复是一个多因素、多途径、多表现的复杂过程，是AS、动脉瘤及支架后再狭窄等临床疾病的共同病理基础。在各种免疫、化学、物理因素作用下，起始于血管内膜完整性的破坏，继而血小板黏附聚集、活化并释放大量趋化因子募集炎症细胞，诱发炎症反应，导致VSMCs迁移至内膜并发生过度增殖。VSMCs参与血管损伤修复的机制目前主要包括“表型转化”学说和“干细胞分化”学说。前者认为在血管发生损伤时，VSMCs能够从收缩表型转化为迁移增殖表型，重新进入细胞周期，正常收缩舒张功能受限，增殖、迁移能力明显增强，利于血管损伤的修复，但在慢性血管炎症刺激下，活化VSMCs的增殖不受控制并分泌大量细胞外基质导致管腔狭窄。随着20世纪50年代造血干细胞和骨髓间充质干细胞的发现以及“干/祖细胞池”概念的提出，干细胞逐渐被证明存在于骨髓、外周血、皮肤、心脏、大脑、血管壁以及很多部位，干细胞分化学说也随之产生。而关于分化为VSMCs的干细胞来源，至今仍存在较大争议，早期认为损伤修复中的VSMCs主要来源于骨髓，并证实了骨髓和外周血中单核细胞的VSMCs可塑性，后来又提出骨髓来源细胞对损伤修复中VSMCs的长期贡献可忽略不计。Hu等[13]发现血管外膜上存在的Sca-1、 CD34和c-kit阳性干/祖细胞可分化为VSMCs参与血管损伤修复，甚至有研究者提出损伤血管内膜中增生的VSMCs完全来源于血管壁原位干/祖细胞[14]。

3.3 VSMCs与心血管疾病 VSMCs作为构成血管壁的主要基质细胞，在AS、动脉瘤及高血压等心血管疾病中扮演着重要角色。AS病变过程中，内膜VSMCs在各种生长因子及炎症因子的作用下迅速增殖并产生大量细胞外基质，导致内膜增厚，中膜VSMCs在各种趋化因子刺激下向内膜迁移进一步加重内膜增厚、管腔狭窄。研究发现VSMCs在高胆固醇和炎症因子的刺激下转化为巨噬样细胞，吸收脂质后进一步转变为泡沫细胞，甚至有研究认为AS斑块中30%的细胞都是发生表型转化的VSMCs[15]。另外，VSMCs的不同表型在AS斑块纤维帽中的作用截然不同，KLF4能促进VSMCs向促炎巨噬细胞样表型转化，不利于斑块稳定，而KLF4基因敲除能使斑块变小变稳定[16]。VSMCs还是高血压的主要病理靶标细胞，肾素-血管紧张素-醛固酮系统活化、交感神经系统活化、氧化应激、血流动力和机械力可诱导VSMCs增生、肥大及对收缩信号的敏感度增加，导致血管收缩、管腔狭窄，血压增高，另有研究发现VSMCs之间的缝隙连接和VSMCs上的离子通道(Cav1.2和Kv通道)也参与了高血压的病理过程[17]。

4 miRs调控干细胞向ECs和VSMCs分化

干细胞是一类具有自我更新和无限分化潜能的细胞，主要分为胚胎干细胞和成体干细胞。随着该领域研究的兴起，干细胞在疾病模型和再生医学领域的应用也逐渐展开。目前在造血干细胞移植治疗领域已成熟应用，而在心血管领域的研究才略见成效。研究发现在缺血动物模型中移植胚胎干细胞/诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)衍生的ECs能促进损伤血管的修复。

4.1 miRs调控干细胞向ECs分化 干细胞向ECs分化是一个复杂却协调的过程，是胚胎时期血管形成和出生后血管修复的重要环节，受到VEGF，碱性成纤维细胞生长因子，骨形态发生蛋白，Notch和Wnt等多水平信号通路的共同调控。miRs是细胞分化的重要调节因子，参与调控干细胞的自我更新和分化[18]。敲除Dicer、Drosha或RNA结合蛋白DGCR8致系统性miRs丢失后，胚胎干细胞的体外分化和增殖发生缺陷。众多研究表明miRs能促进胚胎干细胞向ECs、VSMCs、心肌细胞及骨骼肌细胞分化，其中miRs对ECs定向分化的调控作用是血管领域的研究热点[19-21]。敲除Dicer第一个和第二个外显子的胚胎及卵黄囊血管发育严重受损且血管内皮细胞特殊标记物VEGF, Flt1和Tie-1表达明显降低[22]。在胚胎干细胞分化的ECs群中，发现部分miRs(miR-146b、miR-625、miR-197、miR-210、miR-196、miR-130a和miR-133a)上调，部分miRs(miR-20a、miR-20b、miR-221和miR-222)下调[23]，但至今很少有研究证明这些变化明显的miRs直接调控干细胞向ECs分化。科学家进一步在人胚胎干细胞向ECs分化的早期阶段筛出明显上调的miR-99b和miR-181a并发现与ECs分化时间及状态明显相关，过表达miR-99b或miR-181a使ECs标记物Pecam-1 和 VE-cadherin上调，证明miR-99b和miR-181a能促进人胚胎干细胞向ECs分化[24]。miR-126是在中胚层Flk-1+细胞群中发现的第一个高表达miR，参与调控内皮细胞分化，影响斑马鱼和小鼠的血管完整性[25]。miR-21属于第一批在哺乳动物中发现的miRs，能抑制小鼠胚胎干细胞的自我更新和调节干/祖细胞的定向分化，在Ⅳ型胶原和VEGF诱导iPSC向ECs分化模型中，miR-21表达量明显升高，上调miR-21导致血管ECs标志物表达增加，机制上miR-21通过miR-21/TGFβ-2/SMAD3 和miR-21/PTEN/Akt同时促进iPSCs向ECs分化[26]。在人胚胎干细胞向ECs分化模型中，miR-150和miR-200c同时靶向ZEB1调控ECs分化[27]，而miR-199b靶向Notch配体JAG1，通过分泌转录因子STAT3导致血管源性内皮生长因子激活，促进内皮细胞分化[28]。目前，被证明能直接调控干细胞向ECs分化的miRs并不多，一些新型miRs逐渐被探索，hsa-miR-6086, hsa-miR-6087, hsa-miR-6088, hsa-miR-6089 和 hsa-miR-6090在人来源的胚胎干细胞向ECs分化过程中表达明显变化，使用RNA fold 程序分析，这些新型miRs的前体能形成茎环结构且其5'末端在物种之间高度保守，利用miR 5'末端靶向mRNA 3'UTR端作用机制预测其靶基因，发现CDH5 和endoglin分别为hsa-miR-6086和hsa-miR-6087的可能靶基因并进一步证明hsa-miR-6086 和hsa-miR-6087均通过翻译抑制调控靶基因表达[29]，对于其是否能直接调控干细胞向ECs分化有待进一步证实。

4.2 miRs调控干细胞向VSMCs分化 VSMCs分化同时受到遗传、免疫、环境因素的调节，miRs对干细胞向VSMCs分化的调控一直是心血管界的研究热点。系统Dicer敲除的小鼠胚胎因多能干细胞丢失和血管形成不良致死，特异性ECs Dicer敲除只是影响出生后的血管形成而不影响胚胎存活，但特异性VSMCs Dicer敲除在胚胎发育第16～17天就因广泛内出血致死。体外VSMCs Dicer敲除也出现收缩相关蛋白明显下调及收缩功能受损。以上研究均证明miRs对调控干细胞向VSMCs分化有重要作用。miR-143和miR-145是目前该领域研究最深入的miRs，体内研究发现miR-143/145敲除可诱发VSMCs不完全分化，而体外研究发现miR-143/145可通过靶向转录因子MYO、HDAC7及ETS1抑制干细胞分化多能性，调节VSMCs分化[30-31]。另外，miR-145还能通过PI3K/Akt/mTOR通路调节VSMCs的表型转化、增殖和迁移[32]。上述研究表明miR-145对VSMCs的调控是多方位的。在维甲酸诱导的VSMCs分化模型中，miR-1和miR-10a分别靶向KLF4和HDAC4促进VSMCs分化[33-34]；在鼠胚胎干细胞/血管壁干细胞向VSMCs分化模型中，miR-22介导的VSMCs分化需要通过MECP2进行表观遗传调控，miR-214 通过抑制QKI促进VSMCs分化且QKI可直接结合VSMCs分化转录因子(SRF、MYO)的基因启动子[35]，miR-29a通过负向调控转录因子YY1促进VSMCs分化[36]，miR-34通过上调sirtuin1参与VSMCs分化调节；在TGF-β1诱导的人间充质干细胞向VSMCs分化模型中，miR-503通过靶向SMAD7促进分化，而miR-222-5p通过靶向并下调 ROCK2 和SMαA抑制分化[21]；在TGF-β1诱导人毛囊间充质干细胞向VSMCs分化模型中，miR-128通过靶向SMAD2调节分化过程[37]。越来越多miRs被证明参与调控VSMCs分化的同时，对VSMCs去分化的调节作用也被逐渐发现。miR-221、miR-146a、miR-24和miR-26a促进VSMCs由收缩表型向分泌表型转化，而miR-143、miR-145、miR-21和miR-1促进VSMCs由分泌表型向收缩表型转化。