吲哚菁绿荧光成像技术在肝胆外科的应用进展

梅成杰，张中林，袁玉峰

(武汉大学中南医院肝胆胰外科， 湖北 武汉430071)

吲哚菁绿(indocyanine green，ICG)在机体内的摄取与排泄器官是肝脏，其在评估肝功能和肝血流的应用已经将近60年[1-2]。ICG荧光成像技术是近年出现的新型术中荧光导航技术，在腹部外科众多领域中广泛应用[3]。2008年Aoki等[4]首次报道ICG荧光成像技术应用于肝切除手术，实现解剖性肝段切除。2009年Gotoh等[5]与Ishizawa等[6]报道ICG荧光成像技术应用于肝癌切除术中病灶识别，对肝肿瘤特异性定位。2014年Kudo等[7]报道了第一批接受ICG荧光导航腹腔镜肝切除术的病人肝肿瘤定界及切缘研究。近年来，得益于新型荧光成像系统和荧光导航设备在临床上广泛开发与应用，ICG荧光成像技术快速发展[8-9]。ICG荧光成像引导肝切除术相比传统肝切除术在追求“精准肝切除”上具有显著的优势[10]，在胆道系统疾病的应用上也进行了有益的探索[11]。本文回顾总结PubMed、Embase和Medline数据库相关临床研究并结合笔者经验阐述ICG荧光成像技术在肝胆外科的应用进展及存在的问题。

一、 ICG荧光成像的原理

ICG相比其他花青染料，具有适合的激发和发射波长，其激发波长为750～810 nm，发射波长为840 nm左右，当荧光透过生物组织时，血红蛋白吸收了所有小于700 nm波长的光，水又吸收超过900 nm的红外光[12]。因此，ICG在近红外光激发后，通过近红外荧光摄像机扫描术野及计算机图像处理后，将荧光信号(一般是绿色荧光)呈现给术者。

术前静脉注射ICG后，98%～99%ICG分子能与血浆高分子蛋白如白蛋白、膜蛋白快速结合，并能在37 ℃条件下保持良好的光谱稳定性[12]。ICG在体内仅通过肝胆管系统代谢。通过肝细胞主动转运摄取并由胆道系统排泄，并且不经过肠肝循环。因此，ICG从血浆到胆汁的代谢速率反映了肝脏的代谢功能。在正常肝组织中，ICG能够经肝胆系统在12～24 h内排泄。当存在肝肿瘤或肝硬化结节时，相应胆道排泄功能受损，ICG滞留在病灶内，这些病灶在术中通过荧光成像设备呈现[13]。此外，通过在术中经目标肝段门静脉注射，或阻断目标肝段门静脉后经外周静脉注射ICG，可实现目标肝段正显影或负显影；也可以利用ICG经胆道排泄的特性实现术中胆道造影。

二、ICG荧光成像的使用方法

1.ICG荧光成像系统设备 目前国内外主要荧光成像系统设备有日本Hamamatsu Photonics公司的Photodynamic Eye系统，加拿大Novadaq公司的Pinpoint系统和SPY系统，法国Fluoptics公司的Fluobeam系统[14]，以及中国OptoMedic公司的FloNavi系统[15-16]。随着技术研发和经验积累，ICG荧光成像系统与腹腔镜和机器人手术系统更完美地结合应用，帮助手术医生清晰准确地解剖肝脏。

2.ICG给药方案 目前常用的注射用ICG规格是一瓶25 mg，自带灭菌注射用水10 ml。ICG分子多环结构中的硫酸基决定了灭菌注射用水是ICG首选的溶剂，但ICG水溶液的稳定性有限，应在稀释6～10 h内使用，盐溶液由于促进ICG分子聚集，不可用于ICG的配制[17]。ICG的给药时间、注射途径及注射剂量因病人体质及手术目的而不同，临床研究建议也各有差异。我国2019年版《吲哚菁绿荧光染色在腹腔镜肝切除术中应用的专家共识》[18]建议如下：

(1)肿瘤的识别与定位、明确肿瘤边界、检测残余肝脏：静脉注射ICG 0.05～0.5 mg/kg。①术前2～4 d。②明显肝硬化：5～10 d。

(2)肝分段：①负显示：术中静脉注射ICG 1.0 ml (2.5 mg/ml)。②正显示：术中经目标肝段门静脉注射ICG 5 ml(0.025～0.05 mg/ml)。

(3)划定肝预切线：① 非解剖性肝切除，术中静脉注射ICG 0.05～0.5 mg/kg。② 解剖性肝切除，术中经静脉注射ICG 0.05～0.5 mg/kg或经目标肝段门静脉注射ICG 0.1～0.2 ml(2.5 mg/ml)。

(4)胆管成像：术中经静脉或经目标肝段门静脉注射ICG 1 ml(2.5 mg/ml)。

(5)活体肝移植：①切除供肝：术中经静脉注射ICG 1 ml(2.5 mg/ml)或经目标肝段门静脉注射ICG 0.1～0.2 ml(2.5 mg/ml)。②胆道重建：术中经胆囊管注射ICG 2 ml(2.5 mg/ml)。③血管重建：术中经静脉注射ICG 1.5 ml(2.5 mg/ml)。

(6)检查胆漏：术中经胆管注射ICG 5～10 ml(0.025～0.25 mg/ml)。

另有2019版《计算机辅助联合吲哚菁绿分子荧光影像技术的在肝脏肿瘤诊断和手术导航中的应用指南》[17]建议如下：

(1)肿瘤识别、切缘界定、残余肝检测：静脉注射ICG 0.25～0.5 mg/kg。① ICG15 min滞留率(ICG R15)≤7%，术前给药时间>48 h时，更易获得较好的显影；术前给药时间>5 d，能够获得满意的显影效果。② ICG R15>7%，术前给药时间≥6 d。

(2)肝分段：① 负显示：术中静脉注射ICG 1.0 ml(2.5 mg/ml)。② 正显示：术中经目标肝段门静脉注射ICG 0.1 ml(2.5 mg/ml)与靛蓝二磺酸钠1 ml(1 mg/ml)。

(3)划定肝预切线：①非解剖性肝切除，术前静脉注射ICG 0.25～0.5 mg/kg。② 解剖性肝切除，术中经静脉注射ICG 1 ml(2.5 mg/ml)或经目标肝段门静脉注射ICG 0.1 ml(2.5 mg/ml)与靛蓝二磺酸钠1 ml(1 mg/ml)。

(4)检测肝断面胆漏：术中经胆囊管注射ICG 5～10 ml(2.5 mg/ml)。

(5)活体肝移植：① 胆道重建，术中经胆囊管注射ICG 2 ml(2.5 mg/ml)。② 血管重建，术中经静脉注射ICG 1.5 ml(2.5 mg/ml)。

ICG注射时间、剂量及方法取决于ICG荧光导航方式及手术目的，不同病人之间可因基础肝脏状态而存在巨大差异。笔者团队体会，肝叶反染经外周静脉注射的ICG(1.25～2.5 mg)，或正染经支配门静脉注射(0.125～0.25 mg)，多可达到满意实施荧光引导手术的目的。我们甚至尝试过常规剂量1/10的ICG进行右后叶反染切除引导，亦非常满意。可见，肝脏组织对ICG蓄积明显，荧光敏感，一定范围(而非特定剂量)的ICG剂量均可达到良好染色效果。但是过大剂量时，荧光反应重，随着手术时间的延长，边界可出现浸染效应，导致切肝正染时“多切”或反染时“少切”。因此，笔者建议，应以能实施实现目标肝叶与相邻肝组织的可视荧光分界的最小ICG剂量为准，而没必要追求大剂量、重染色。对于肝外胆道排泄性造影，本中心经验是1 mg剂量外周静脉注射基本能够满足胆囊/胆管手术显影需求且能够避免等待时间过长、肝门区浸染等问题。

三、ICG荧光成像在肝胆外科的应用

1.肝肿瘤检测识别 分子荧光成像技术在检测肝表面潜在的微小肿瘤结节(包括转移性肿瘤)具有高度敏感性，相比术前影像和术中超声在显示肝包膜附近的微小病变具有明显优势[19]。Boogerd等[20]对26例疑似肝癌的病人行不同方式检查的敏感度分别为80%(CT)，84%(MRI)，86%(腹腔镜超声)和92%(ICG荧光成像);3个转移瘤(12%)仅由ICG荧光成像识别。Kaibori等[21]对比ICG和5-氨基乙酰丙酸两种染料荧光成像，检测肿瘤敏感度为96%比57%，特异度为50%比100%,准确度为94%比58%。Terasawa等[22]对53例术后病例回顾性研究发现，ICG荧光成像成功显示45个病灶(85%)，其中3个结直肠肝转移病灶无法通过术中超声确定。术中通过ICG荧光成像能够识别小至1 mm的浅表肿瘤。

Abo等[23]回顾117例病人研究指出术中超声对恶性肝肿瘤的诊断准确性(94%)优于ICG荧光成像(75%)，ICG荧光成像诊断假阳性率与假阴性率分别为24%和9%。Kose等[24]研究发现，在144个肝肿瘤病灶中(62个浅表病灶与82个深部病灶)，腹腔镜超声检查确定了92%，ICG荧光成像确定了43%。ICG荧光成像能检测95%的浅表病灶，但深部病灶为4%。ICG荧光成像仅特异性检出3%的浅表病灶，ICG荧光检测受肿瘤病变在肝组织深度制约明显。Peyrat 等[25]报道ICG荧光法检测肿瘤的最大深度为13 mm。提示ICG荧光成像联合术中超声可较准确地检测肝肿瘤。Masuda等[26]通过对84个终末期肝病活体肝移植病人的肝切除灶检测发现， ICG荧光成像的敏感性、特异性和准确性分别为72.2%、31.8%和40.5%，而多排螺旋CT(MDCT)的敏感性、特异性和准确性分别为66.7%、92.4%和86.9%。对于伴肝硬化肝癌病人，ICG荧光成像检测特异性明显较低。

术中ICG荧光辅助识别肝表面微小肿瘤病灶最大的困境在于,非特异性荧光非常普遍——显著肝硬化者尤甚,导致特异性不高。笔者单位送检术中偶然发现的在普通白光下不易识别病灶(包括表浅及深部病灶)8枚，其中2枚证实为肿瘤性病变(原发性肝癌1枚，乳腺癌转移瘤1枚)，占术中意外发现荧光病灶的25%(2/8)，另6枚证实为汇管区组织慢性炎症并胆管增生，其在术中荧光显像推测为肝内局部微胆管扩张并局限性胆汁淤积所致[27]。导致肝内异常局灶性荧光的因素众多，肝脏表面微小囊肿、部分肝硬化结节、肝脏局灶性结节性增生(FNH)等也在术中荧光融合中表现为局灶性绿色荧光结节。术前影像不易呈现靠近肝包膜的微小病灶，即便是术中超声，对显著肝硬化病人肝表面微小病灶的识别也非常困难。因此，ICG荧光标记与术中超声相结合，能够取长补短，为术中发现与识别肿瘤肝内转移的有效手段。

2.肝肿瘤荧光表现 肝肿瘤导致胆汁排泄微环境的改变。术前静脉注射ICG后，正常肝脏组织可在12～24 h内完成对ICG的排泄，而肿瘤实质中的微胆管破坏则导致ICG排泄受阻[28]。分化良好肝癌组织内Na+-牛磺胆酸盐共转运多肽和有机阴离子转运蛋白摄取和积聚ICG，形成完整荧光信号[13]。而低分化肝癌组织的转运蛋白下调，周围非癌性肝组织胆管结构紊乱，ICG排泄受阻，形成边缘型荧光信号[29]。转移性肝肿瘤缺乏正常肝细胞功能，压迫周围正常肝组织胆汁排泄，通常也表现为边缘型荧光[30-31]。

Kaibori等[32]根据荧光成像特点将190例肝癌切除标本的ICG荧光图像分为两组[癌性成像组(HC组)和周围组织成像组(HS组)]。他们发现，肝硬化组织在HC组明显多于HS组。在HC组病人中，高分化肝癌组织通常表现为部分荧光型，比例高于全荧光型(48%比10%)。HS组中，低分化肝癌组织全部表现为环型荧光。He等[33]研究提示ICG荧光成像对静脉癌栓能够呈现3种荧光：完整荧光(高分化66.7%，中低分33.3%)，部分荧光(中低分化76%，低分化24%)，边缘荧光(中低分化60%，低分化40%)。此外，ICG荧光成像技术对肝癌在腹腔的转移灶也可以显示出清晰完整的荧光信号。

3.肝切缘界定 肿瘤完全切除率(R0)是判断手术疗效的标准之一。在普通肝切除术中，肉眼很难判断肿瘤与切缘的安全距离，安全切除距离不够可能导致肿瘤残余。另一方面，外科医生需要为病人保留足够的残余肝来维持肝功能。因此，准确的切除范围对病人的预后至关重要。

Liu等[34]通过对50例肝切除病人(分为ICG荧光组与超声组)比较发现，ICG荧光组R0切除率为100%(25例完全切除)，超声组R0切除率为96%(24例完全切除)。ICG荧光组有1例手术切缘距肿瘤1 cm内，而超声组有7例(P=0.049),表明ICG荧光成像可保证肿瘤与切除边缘之间的安全距离。数项研究[35-37]均表明ICG荧光导航肝切除相比普通肝切除具有更高的R0切除率。

笔者体会，术前ICG注射引导的肿瘤荧光显像对肿瘤深在的中央区或右后区肝脏手术具有特别重要的价值[38]。中央区深部肿瘤，或者深在的右后区肿瘤，即使结合术中超声，切肝过程中仍存在深部肝组织中不易定位、容易偏离的难题，若结合术中ICG荧光，则可实现实时定位肿瘤，避免切少(切破肿瘤或切缘不足)或切多(误切可保留或必须保留的重要管道)的危险，从而提高肿瘤根治性和手术安全性。

4.肝段染色定位 解剖性肝切除相比常规肝切除可能有更多的肿瘤学获益[39]，也存有争议[40-41]。肝脏解剖结构复杂，脉管结构变异多，肝脏段-段间实际分界呈地图状立体交错分布，既往以肝血流阻断和术中超声为基础的解剖性肝切除术，很难做到真正意义上的“解剖性”切除[42]。Ishizawa等[43]首次报道了他们在腹腔镜手术中应用ICG荧光成像显示肝段的两种方法——经目标肝段门静脉分支注射ICG(正染)和结扎目标肝段肝蒂后经外周静脉注射ICG(负染)。此后，Kobayashi等[44]根据肿瘤分级及门静脉栓塞情况，将肝段染色分为单染、多染、复染、阴性染色及反阴性染色5种染色方式。便于实时清晰显示门静脉区，增强了对门静脉区解剖切除的效果。Ueno等[45]报道了联合血管造影和ICG荧光成像技术进行肝脏精准切除，增强了染料的视觉效果。值得注意的是，过多的ICG进入体循环会导致全肝染色，控制肝动脉或间歇性阻断肝血流可以延长肝段荧光显像可视化时间[46]。

我国2019年版ICG荧光导航手术应用指南[17]建议，根据肝段位置、肝蒂解剖难度，S1、S4宜使用负染色法，S2、S3、S5、S6正负染色均易实现，S7、S8宜使用正染色法。Inoue等[47]研究显示，ICG荧光成像技术在24例病人中有23例(95.8%)达到有效分界肝段，而常规肝段分界技术仅在10例病人中达到有效分界(41.7%)。Miyata等[46]比较了ICG染色和靛胭脂染色对肝横断面切线的显影效果，发现靛胭脂染色技术有效识别17例(57%)，ICG染色对肝段有效识别是100%。Yang等[48]采用联合ICG荧光成像与三维实质染色引导下肝切除，实现了三维可视化系统计算的预测肝切除体积与实际肝切除体积的一致。

以ICG荧光标记肝段为基础的解剖性肝脏手术，有两点值得注意：首先，由于肝脏解剖学上天然分布的众多肝段供血管道变异，不管采用正染或反染方法，均有成功率限制，技术上面临天然瓶颈。其次，荧光肝分标记技术用于引导解剖性肝切除手术虽然提供了前所未有的精准性，但不等于绝对化解剖性肝段，临床具体应用需兼顾肿瘤学根治性和外科学安全性的综合考量。笔者工作中曾遇到肝段荧光界限与肝静脉分段不一致、ICG荧光边界非最佳肿瘤切缘的情况，术中临时变更手术计划，改行循肝右静脉的解剖性右后叶切除手术。因此，把ICG荧光成像技术，与基于薄层影像的术前可视化三维重建及流域分布/体积评估技术、肝血流阻断技术、术中超声技术等手段综合起来，灵活运用，对病人采取合理的个体化手术方案，是关键所在。

5.胆道显像及胆漏检测 术中常规胆道造影由于耗时，辐射暴露且本身易损伤胆管，临床上褒贬不一[49]。ICG在机体内唯一排泄途径是经胆道排泄的特点意味其可以作为术中胆道显影新的方法，用于显影肝外胆管以减少医源性胆管损伤，或识别术中胆漏。Daskalaki等[50]报道了184例进行ICG荧光胆道造影，在99%的病例中可以看到至少一个胆道结构，胆囊管、胆总管和肝总管成功显影率分别占97.8%、96.1%和94%，且无发生胆道损伤。Pesce等[11]研究提示在解剖卡洛氏三角后，胆囊管、肝总管、胆总管识别率显著提升。系统评价[51-52]提示，ICG荧光造影可以显著提升对重要胆道解剖结构的检测敏感度，对于萎缩性胆囊、再次胆囊或胆管手术等肝门区胆道结构显示不清的手术，有助于预防胆管损伤。

根据ICG注射途径不同可分为外周静脉注射(排泄性胆道造影)和胆道注射显影两种方式，用于肝外胆道显影或胆漏检测。外周静脉注射后最快10 min后肝外胆管即可呈现荧光；直接胆道注射(经肝内、外胆管、胆囊或胆囊颈管)适宜浓度的ICG可产生即时性荧光。因与蛋白结合的ICG荧光浓度约0.25 mg/ml，ICG在较高浓度下对近红外光的吸收能力降低，故为获得胆管内注射ICG后胆管的清晰荧光图像，可将ICG溶液稀释到0.025 mg/ml用于造影。既往曾有Graves等[53]报道11例经胆囊直接注射ICG，仅1例因胆囊管被结石完全阻塞而未能显示胆囊管的全长，但在本中心的实践中发现，因胆囊质软，容积较大，操作中易胆汁渗漏、污染术区视野。

胆漏是肝切除术后常见的并发症，其发生率一直维持在4%～13.8%[54]。Sakaguchi等[55]较早报道了在27例肝切除术后进行ICG荧光成像后，修复8例胆漏，且术后无胆漏发生，而32例进行常规注水检测法术后发生了2例胆漏。Kaibori等[56]研究对比ICG荧光成像手术组与对照组，术后胆漏率分别为0%与10%。笔者体会，不管是正染还是反染，肝实质离断后断面浸染会显著降低ICG荧光识别胆漏的分辨度和效率，因此，应在断面完全止血并清洗去污后进行，必要时追加注射ICG，尽管可能存在视觉上的困难，但该方法仍不失为发现胆漏的有益手段。

6.病人预后 Handgraaf等[57]多中心回顾性分析ICG荧光成像引导下结直肠癌肝转移切除术后病人。86例病人中4年无复发生存率为47%，相比87例常规肝切除病人为39%[多变量分析风险比为0.73，95%CI(0.42，1.28)，P=0.28]。 4年总生存率分别为62%和59%(P=0.79)。45例病人通过ICG荧光成像切除了肝外转移灶，并在3年随访中未发生复发。Zhang等[58]对30例ICG荧光导航腹腔镜肝切除手术病人和34例常规腹腔镜肝切除病人回顾性分析，结果显示，ICG组失血量更少(P=0.047)，术中输血率更低(P=0.045)，术后住院时间更短(P<0.001)。Qi等[59]通过纳入587例病人进行Meta分析，提示ICG荧光成像导航肝切除术有效减少手术时间、失血量、住院时间和术后并发症，而术后死亡率、1年复发率无显著差异。

四、问题与展望

ICG荧光成像技术作为一种新型医疗影像技术，联合腹腔镜或机器人平台在肝胆外科领域，尤其是浅表微小肿瘤识别，辅助精准肝切除，降低术后并发症等方面发挥了极大的作用。但也有诸多问题有待于解决：第一，肝脏ICG显影敏感，各种小结节的非特异性荧光显像十分普遍，是ICG应用过程中面临的困惑之一。第二，ICG代谢受肝脏基础状况影响较大，如何根据肝功能状态确定个体化给药按剂量，达到最佳荧光成像效果，也是临床应用中面临的问题。第三，术中ICG注射荧光有可识别术中胆漏的优点，但时有肝断面浸染导致胆漏识别效率不高甚至无法识别的问题。第四，肝脏解剖结构复杂，管道变异多，受此影响导致的解剖性目标肝段显影成功率有限。因此，在诸多不利因素客观存在的现实中，将各种手段合理结合、运用，才能有助于发挥ICG荧光引导肝脏外科手术的最大价值。