聚赖氨酸/细菌纤维素抗菌敷料毒性及抗菌性能的检测*

王金海 朱宏阳 李泳宁

(福建卫生职业技术学院药学系，福建 福州 350101)

细菌纤维素(Bacterial cellulose,BC)具有良好的生物相容性，水合度很高，韧性又强，作为抗菌敷料，有利于限制感染并能使伤口快速愈合，同时BC可以被灭菌，易于吸收渗出物并易于储藏处理。因此，BC在治疗皮肤损伤、防治伤口感染以及人工皮肤等方面具有广泛的用途，是一种天然的创伤敷料[1-2]。ε-聚赖氨酸(ε-Polylysine,ε-PL)是由赖氨酸残基通过ε-氨基和α-羧基构成的肽键连接而成的高分子聚合物，是一种新型的具有较好抑菌功效的生物防腐剂[3]。由于ε-PL在人体内可分解为人体必需的L-赖氨酸,因此ε-PL也是一种较高安全性的天然食品防腐剂,具有水溶性好、抗菌谱广等特点,具有潜在的商业利用价值[4]。目前我国已批准ε-PL作为食品防腐剂应用于熟肉制品、焙烤制品以及果蔬汁[5-6]。从应用角度来讲,ε-PL能否与其它物质配合使用,同时提高ε-PL的抗菌活性是一个值得深入探讨的问题,学界对此也进行了大量研究[7-8]。本研究在前期工作中以具有自主知识产权的BacillusamyloliquefaciensZF-7(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为：CGMCC No. 6266)为出发菌株[9]，将ε-PL均匀吸附在BC上制备获得聚赖氨酸/细菌纤维素抗菌敷料PLBC，并通过对其细胞毒性、生物相容性及抗菌性能进行检测，筛选出合适浓度的抗菌敷料PLBC。

1 材料与方法

1.1 主要材料

ε-聚赖氨酸由南京轩凯生物科技有限公司提供，细菌纤维素由本实验室制备，新西兰白兔及SPF级昆明种小鼠购自于上海斯莱克实验动物有限公司(许可证号:SCXK(沪)2017-0005)，小鼠成纤维细胞L929和人胚肝细胞系L02细胞由中国科学院上海细胞生物学研究所提供，实验菌株由南方医科大学微生物研究所提供。

1.2 抗菌敷料PLBC的制备

将若干BC膜片(本实验组制备)浸泡于100mL一定浓度(0、0.5%、1.0%)PL溶液中，并将其置于超声清洗器中超声震荡，使BC与PL能充分接触吸附均匀，总吸附时间为1h，分3次重复震荡，间隔时间10min。将吸附后的膜片放入浓度为15%甘油中，1～2s后迅速取出，取出后沥干表面多余液体，于60℃烘箱烘干至恒重，供测试使用。

1.3 细胞毒性检测

1.3.1 受试样品浸提液制备

称重受试敷料，严格高压灭菌，用RPMI1640培养液稀释，使各无菌试管的敷料质量浓度为100g/L,置37℃培养箱浸提48h。用微孔过滤器过滤后制成PLBC浸提液，置4℃冰箱保存，备用。以二甲基亚砜为阳性对照、RPMI1640培养液为阴性对照。

1.3.2 SRB法检测PLBC体外对L02细胞增殖的影响

取对数生长期的L02细胞，接种于96 孔板上，100 μL/孔，细胞数3000个/孔，静置15 min。培养24 h 后，每孔加100 μL PLBC，终浓度分别为1.00、2.00、4.00、8.00mg/mL，阴性对照组加培养液100 μL/孔，阳性对照组加5%的二甲基亚砜100 μL/孔，每组设4个复孔。置常规培养条件下作用24 h后，电子显微镜下观察细胞生长状况，SRB染色液染色，用酶标仪测量吸光度，计算细胞增殖抑制率。

1.3.3 CCK-8法检测PLBC体外对L929细胞活性的影响

在24孔细胞培养板中接种浓度为2×105/mL的L929细胞悬浮液，种植15个孔，每组5个孔。培养24h后换液，分别在终浓度分别为1.00、2.00、4.00、8.00mg/mL PLBC组细胞培养，液液面滴1μL相对应的浸提液，待浸提液凝固后形成的混合液中调整浸提液浓度为1%。作用24h后换液，接着每孔中加入100μL CCK-8试剂，用酶标仪测量OD值，通过公式计算出细胞生长活性。

1.4 急性全身毒性实验

取SPF级昆明种小鼠30只，体重约20g，雌雄各半，将小鼠随机分为实验组、阴性对照组、阳性对照组，每组10只。无菌条件下，按1mL/20g剂量标准将PLBC浸提液注入实验组腹腔内，阳性对照组注入等量苯酚，阴性对照组注入等量生理盐水。连续观察14天，记录小鼠注射后1d、7d、14d呼吸、进食、毒性反应、体重变化或死亡。

1.5 溶血度测定

耳缘静脉抽兔血4mL，制成新鲜的抗凝稀释兔血。取5mL实验组敷料浸提液置于离心管中，并用去离子水和生理盐水设置阳性与阴性对照组，每组6只管，置于恒温水浴箱中0.5h。将制作好的兔血0.1mL滴入各组中，混匀，静置恒温水浴箱1h，离心5min，观察各管颜色及溶血现象。分别取200μL各管中的上清液添加到96孔板中。酶标仪测定各样本OD值后计算出溶血度。

1.6 抗菌性能检测

选用临床常见三种菌株：大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)作为实验用菌，采用抑菌圈法，将菌液均匀涂板后，在各板上贴附四种浓度PLBC敷料剪成直径为10 mm 的小圆片，放置于细菌培养箱培养 24 h 后，计算抑菌圈大小。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 SRB法检测PLBC体外对L02细胞增殖的影响

培养 24 h 后，各浓度PLBC敷料组的细胞，贴壁生长好，细胞呈长梭形，可见核分裂细胞。阳性对照组细胞核固缩，细胞密度下降，死亡细胞多，少数贴壁细胞聚集成团。SRB法检测结果显示，不同浓度的PLBC(1.00、2.00、4.00、8.00mg/mL)作用于L02细胞24h的抑制率分别为95.67%±0.26%、94.34%±0.15%、94.92%±0.23%、92.19%±0.34%，P<0.01(表1)，根据国际医疗器械生物学评价细胞活性必须高于70%的标准，PLBC的细胞毒性符合国际标准。

表1 各组敷料作用于L02细胞的细胞相对增殖率及毒性评价

2.2 CCK-8法检测PLBC体外对L929细胞活性的影响

实验结果显示，两种不同敷料对细胞的生长均有抑制作用，其中BC组细胞活性为78.23%±5.18%，PLBC组为81.95%±3.57%，两组敷料对细胞生长活性影响差异无统计学意义(P>0.05)，但与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)，详见表2。因加入细胞培养液中任何非细胞培养所必需的物质均会对细胞有不同程度的毒性作用，根据国际医疗器械生物学评价细胞活性必须高于70%的标准，PLBC的细胞毒性符合国际标准。

表2 CCK-8法检测PLBC间接接触L929

2.3 急性全身毒性实验

各组小鼠体重增长见表3，比较三组间实验动物的体重变化，结果显示，实验组PLBC对小鼠生长基本无影响，差异无统计学意义，而阳性组小鼠体重增长明显减少。实验结果显示，阴性组各小鼠未见任何不良反应，体重呈增加趋势，无死亡；实验组各鼠活动正常，未发现呼吸抑制、步态不稳、惊厥等毒性反应，无一死亡，体重呈增加趋势。阳性组第一天死亡3只，其他小鼠出现震颤、潮式呼吸，活动下降，体重无明显增加。

2.4 溶血实验

实验组PLBC浸提液离心管和阴性对照管离心后，上清液均为无色透明液体，红细胞沉积管底，无明显溶血现象。阳性对照组液体则呈艳粉色，底部未见明显沉积，可见红细胞破裂溶解。采用单因素方差分析比较三组间的吸光度值，差异具有统计学意义(P<0.01)，两两比较提示各组间均有差异(P<0.01)，如表4所示。

表3 急性全身毒性实验小鼠的体重变化 单位:g

表4 各组材料OD值及溶血率

2.5 抗菌性能检测

抑菌圈提示，4组不同浓度的PLBC敷料其抑菌圈大小呈浓度依赖性，而BC组敷料在三个菌株中均未见明显抑菌圈。在对三个菌株的抑菌圈中，不同浓度(1.00、2.00、4.00、8.00mg/mL)的PLBC所产生的抑菌圈大小分别为10.7～12.2mm、12.9～13.6mm、13.8～14.5mm、14.7～16.1mm)(图1)。

图1 五组敷料对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌的抑菌圈柱形图比较

抑菌圈检测法反映了PLBC与微生物直接接触后的抑制性能，真正发挥抗菌作用的是吸附在纤维上的聚赖氨酸，其抗菌能力随聚赖氨酸浓度升高而增加，而细菌纤维素作为敷料载体，本身并不具有抗菌性能。

3 讨论

促进创面愈合是外科领域研究的热点课题，如何有效防止创面感染是其重点研究方向。保护创面、防止并治疗创面感染及加快创面愈合，已成为促创面愈合的研究热点[10-11]。治疗创面的常规方法是用可覆盖创面并能杀灭病菌及促进伤口愈合的敷料覆盖，不仅能为促进伤口愈合提供良好的微环境，还能有效防止感染、减少并发症。近几十年来，医用抗菌敷料研究发生了突破性的发展，尤其是生物基医用抗菌敷料获得突飞猛进的进展[12-13]。现如今生物基医用抗菌敷料是在创伤修复“湿润愈合”理论基础上发展起来的新型材料，与传统敷料相比，其具有加速创面愈合、提高创面愈合质量、降低感染、避免创面粘连、减轻患者痛苦及方便使用等特点[14]。

BC因其具有超细纤维、高结晶度、高纯度、高持水性、良好的机械性能、良好的生物相容性及生物可降解性，在医学领域得到广泛的应用，已成为极具潜力的新材料[15]。ε-PL在人体内可分解为人体必需的赖氨酸，是一种营养型抑菌剂，其安全性优于其他化学抑菌剂[16]。本研究将ε-PL吸附在BC中制备获得聚赖氨酸/细菌纤维素抗菌敷料PLBC，评价材料的细胞毒性的实验方法有很多种，其中CCK-8具有简便、灵敏、快速等特点，结果客观性强、重复性好，是目前体外评价生物材料增殖活性的最常用方法[17]。SRB法具备MTT法操作简便、敏感的特点,同时测量结果不受时间影响,尤其适用于大规模药物筛选及毒性评价[18]。L02细胞是人胚肝细胞，是细胞毒性实验中的标准细胞之一[19-20]。 本研究通过采用SRB法和CCK-8法检测抗菌敷料PLBC，根据国际医疗器械生物学评价之体外细胞毒性试验细胞活性必须高于70%的标准，PLBC的细胞毒性在标准范围内，其细胞毒性符合国际标准。医用生物敷料的溶血实验是评价材料体外溶血活性、鉴定生物相容性的最基本实验之一。本研究采用溶血实验及全身毒性实验检测PLBC，发现其不引起溶血反应，无急性全身毒性反应，具有良好的生物相容性。微生物检定法中测定药物效价常用抑菌圈法，通过抑菌圈的大小来直观展示药物效价[21]。本研究通过抑菌圈法测定不同浓度的PLBC及空白组对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌三种菌株的抑菌性能，实验结果显示，BC本身不具备抗菌性能，PLBC的抑菌性能由吸附于BC的PL发挥，且抑菌性能随PL浓度升高而增加。

本实验制备的聚赖氨酸/细菌纤维素抗菌敷料PLBC体外无明显细胞毒性，体内不引起溶血反应，无急性全身毒性反应，具有良好的生物相容性及抗菌性能，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌等临床常见菌株均有明显的抑制作用且呈浓度依赖性，因此是一种理想的抗菌敷料。