湖南龙山不同海拔中华蜜蜂种群遗传多样性的微卫星DNA分析

徐 浩,陈孝梅,蔺哲广,吉 挺

(扬州大学动物科学与技术学院,江苏扬州 225009)

中华蜜蜂Apisceranacerana(简称中蜂)，作为东方蜜蜂Apiscerana的指名亚种，广泛分布于除新疆以外的全国各地(国家畜禽遗传资源委员会,2011)。中华蜜蜂资源评价与保护研究对维持我国生态系统平衡起着关键作用，对保持生物多样性具有重要的意义。近年来我国中华蜜蜂遗传资源在诸多领域开展了大量研究，而在遗传资源中遗传多样性是衡量物种适应外界环境变化能力，反映物种进化潜力的重要指标，同时也是开展遗传育种工作的的重要依据(陈灵芝和马克平,2001)。龙山县属于湖南省西北部，地处云贵高原东北侧与鄂西山地西南端结合部，武陵山脉斜贯全境，地势北高南低，岭谷相间、高差悬殊，气候温暖湿润，冬少严寒，夏少酷暑，植被丰茂，自然洞穴多，适宜多种动物繁殖生长。得天独厚的自然环境使得蜜蜂资源丰富，掌握当地中华蜜蜂遗传资源概况以及合理保护与利用显得尤为重要。

微卫星DNA (microsatellite DNA)，又称简单串联重复序列(simple sequence repeat,SSR)，由微卫星核心序列及其两端的侧翼序列两部分组成(Vaimanetal.,1995)，具有数量多、分布范围广、呈共显性遗传、多态性丰富和检测方便等特点。目前微卫星标记在遗传学中的应用，特别是在群体遗传结构和遗传多样性研究方面应用广泛(吉挺等,2007)。前人运用微卫星DNA遗传标记的方法已经对吉林长白山地区(于瀛龙等,2013)、江苏太湖地区(吉挺等,2014)、青藏高原地区(周丹银等,2019)、秦巴山区(郭慧萍等,2016)、海南(徐新建等,2013)、沂蒙山(郗学鹏等,2018)等地区的东方蜜蜂进行了种群遗传多样性分析。以前由于采样地点的限制，研究东方蜜蜂种群遗传多样性的样品都是分散在各地，而对于同一地区不同海拔样本的微卫星标记分析遗传多样性的研究还没有开展，随着科学技术的发展以及山区道路的顺畅，对于同一地区不同海拔的样本采集研究很有必要。

已有研究发现在中国云南省，海拔高于2 000 m的中华蜜蜂种群比低地种群个体体积更大、体色更黑、体毛更长(Pereboom and Biesmeijer,2003;罗林娟和谭垦,2008)，这些形态上的变化可能代表着种群对生境的适应，致使基因发生变化，从而影响种群遗传多样性。从海拔因素研究种群遗传多样性，对研究种群进化，分析遗传结构具有重要意义，同时也可验证种群适应环境使得基因组区域改变，能否影响种群遗传多样性。本研究利用11对微卫星标记引物对武陵山区湖南省龙山县区域两个不同海拔总计60群中华蜜蜂进行微卫星DNA标记，分析遗传多样性水平，探索海拔因素对蜜蜂遗传多样性的影响，为武陵山区蜜蜂遗传资源的保护与利用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 样本采集

采集位于湖南省湘西土家族苗族自治州龙山县大安乡两个不同海拔(1 080和665 m)的中华蜜蜂各30群(表1)，所采蜜蜂均为当地长期饲养的中华蜜蜂，每个蜂群采集成年工蜂10～20头，保存于75%无水乙醇中。

1.2 主要试剂和仪器

血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(天根)，TaKaRa TaqTM(TaKaRa)，用于制作琼脂糖凝胶的Agarose-Molecular Biology Grade(Biofroxx)，MASTERCYCL基因扩增仪(Eppendorf)，微量紫外可见分光光度计(NanoDrop ND-1000)，5810R台式高速冷冻离心机(Eppendorf)，低速小型离心机(Sigma)，XW-80A漩涡振荡器(IKA)，DYY-6C型电泳仪(北京市六一仪器厂)。

1.3 微卫星标记引物PCR扩增中华蜜蜂基因组DNA

本研究参考陈孝梅等(2019)设定的中华蜜蜂微卫星引物，从中选择了11对扩增效果较好的微卫星引物并设温度梯度摸索退火温度，具体引物信息见表2。

表2 引物信息Table 2 Primer information

从每群10～20头中华蜜蜂成年工蜂随机取1头，采集其头胸部，参照吉挺(2009)建立的方法提取DNA，用微量紫外分光光度计(NanoDrop ND-1000)测定其浓度，-20℃保存。PCR反应体系(20 μL):10×Buffer 2.0 μL,dNTPs (10 mmol/L) 2.0 μL,上下游引物(10 pmol/μL)各1.0 μL,Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.2 μL,DNA模板(100 ng/μL) 1.0 μL,超纯水12.8 μL。PCR扩增程序:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,53.8～63.9℃(具体见表2)退火50 s,72℃延伸50 s,30个循环;72℃再延伸10 min,4℃保存。配制2%琼脂糖凝胶80 mL，加入3 μL核酸染色剂，点样6 μL,120 V电泳30 min，检查产物的有无。

1.4 PCR产物STR分型测序

PCR荧光产物由上海生工生物工程有限公司进行STR分型测序，通过GeneMapper4.0软件生成图谱，从图谱中读取片段长度、峰值和峰面积，并从中分辨出纯合子或杂合子(纯合子：单峰；杂合子：双蜂)，绘制出的图表用于指标分析。

1.5 种群遗传多样性分析

通过Excel Microsatellite-Toolkit软件计算每个群体各基因座的优势等位基因频率(dominant allele frequency,Pi)、期望杂合度(expected heterozygosity,He)和多态信息含量(polymorphism information content,PIC)(Park S,2001)。根据FSTAT程序(Goudet,1995)计算群内近交系数(inbreeding coefficient,Fis)。用SPSS 25.0软件分析两个群体间Pi,He,PIC和Fis的差异显著性。

2 结果

2.1 微卫星位点PCR扩增产物分型结果

龙山县高海拔(1 080 m)低海拔(665 m)中华蜜蜂种群中11个微卫星位点共检测到88个等位基因，各位点遗传变异程度不等，单个位点检测到2～12个等位基因，其中高海拔种群G中平均等位基因数为8.2，低海拔种群D中平均等位基因数为7.8，高海拔地区种群比低海拔地区种群等位基因数略高。

中华蜜蜂高海拔种群个体G13在BI299位点核心序列相差4 bp，表现为双峰，为杂合子，基因型为146/150(图1:A)；D16在A028位点核心序列表现为单峰，为纯合子，基因型为110(图1:B)。二者杂峰污染较少，扩增效果良好。从分型结果来看高低海拔种群在A088和AG005C两个位点均为纯合子，11个微卫星位点中低海拔种群的纯合子数比高海拔的纯合子数略多，但无显著性差异(P=0.724>0.05)，具体见表3。

图1 湖南省龙山县部分中华蜜蜂种群个体在微卫星位点上的STR分型结果Fig.1 STR typing results at microsatellite loci for some individuals of Apis cerana cerana populations in Longshan County,Hunan ProvinceA:G13蜂群个体在微卫星BI299位点的STR分型结果STR typing result for individuals of G13 colony at the microsatellite site BI299;B:D16蜂群个体在微卫星A028位点的STR分型结果STR typing result for individuals of D16 colony at the microsatellite site A028.

表3 湖南省龙山县高低海拔中华蜜蜂种群微卫星位点纯合子与杂合子分布情况Table 3 Distribution of homozygotes and heterozygotes of microsatellite loci in high and low altitude populations of Apis cerana cerana in Longshan County,Hunan Province

2.2 高低海拔中华蜜蜂种群Pi比较

本研究采用微卫星DNA标记，利用one-way ANOVA分析方法对G和D两个群体的Pi进行处理，分析龙山县高低海拔的中华蜜蜂种群遗传多样性。结果表明，龙山高海拔和低海拔的中华蜜蜂种群的遗传多样性均较丰富，两者均具有较高的遗传多样性，G和D两个群体在这11个微卫星标记检测出的优势等位基因上无显著性差异(PPi=0.721>0.05)(表4)。

表4 湖南省龙山县高低海拔中华蜜蜂种群在11个微卫星位点的优势等位基因及其频率Table 4 Dominant alleles and their frequencies in 11 microsatellite loci of high and low altitude populations of Apis cerana cerana in Longshan County,Hunan Province

2.3 高低海拔中华蜜蜂种群He,PIC和Fis比较

中华蜜蜂高海拔种群的He,PIC和Fis平均值分别为0.593,0.556和0.121，均略低于低海拔种群的0.631,0.587和0.187，对两个不同种群的He,PIC和Fis进行one-way ANOVA分析结果显示，两个种群间He,PIC和Fis均无显著性差异(PHe=0.759>0.05,PPIC=0.802>0.05,PFis=0.767>0.05)(表5)。

表5 湖南省龙山县高低海拔中华蜜蜂种群在11个微卫星位点的PIC,Fis和He的比较Table 5 Comparison of PIC,Fis and He in 11 microsatellite loci of high and low altitude populations of Apis cerana cerana in Longshan County,Hunan Province

本研究中，龙山县高海拔与低海拔中蜂种群的PIC平均值均略高于0.5(PICG=0.556,PICD=0.587)，位点为高度多态性位点，且低海拔中蜂种群的PIC值比高海拔的略高。两个种群的He平均值都较高(HeG=0.593,HeD=0.631)，反映了二者都有着相对丰富的遗传多样性。两个种群的Fis平均值均大于0(FisG=0.121,FisD=0.187)。

3 讨论

优势等位基因频率(Pi)是指一个群体中某一基因对其等位基因的相对比率(张翠霞,2008)。优势等位基因，即该物种中最原始、最保守的等位基因，其余等位基因是进化过程中由该等位基因突变形成，因此微卫星的多态性能够反映物种的进化历史(钟金城等,2006)。本研究中龙山高海拔和低海拔的中华蜜蜂种群在这11个微卫星标记检测出的优势等位基因上无显著性差异(PPi=0.721>0.05)(表4)，表明龙山县地区高低海拔的中华蜜蜂种群遗传分化较小，而海拔因素不能直接影响其多样性程度。

群体内近交系数(Fis)常用于衡量群体内偏离哈代-温伯格平衡的程度，当Fis=0时，表示配对方式为随机交配；当Fis>0时，表示群体内发生了近亲交配；当Fis<0时，表示异型交配(杨香娣,2016)。本研究中龙山县中华蜜蜂高海拔种群与低海拔种群Fis平均值均大于0(FisG=0.121,FisD=0.187)(表5)，说明两个种群中均出现近亲交配的现象，这与当地环境密切相关，因为高低海拔的中华蜜蜂群体均分布在武陵山脉中，环境较为封闭，中蜂近亲交配在所难免，需要引起关注并采取保护种群的措施。

在微卫星数据分析中常用的多样性分析指标，其中很重要的一个是基于等位基因分布的杂合度分析(Nei,1987;Leberg,2002)。通常群体中微卫星座位杂合子的比例用杂合度(H)来表示，即某一基因座上等位基因间杂合的程度(王利刚,2006)。群体平均杂合度以0.5为界，高于0.5表明该群体拥有丰富的遗传多样性；平均杂合度低于0.5时，表明该群体遗传多样性较低，群体受到高强度的选择。观察杂合度(Ho)容易受样本大小的影响，一般不采用，而期望杂合度(He)更能够反映群体的遗传多样性(包文斌等,2007)。本研究中，中华蜜蜂高海拔和低海拔两个种群的He都较高(HeG=0.593,HeD=0.631)(表5)，反映了二者都有着相对丰富的遗传多样性。种群遗传多样性越高，种群适应性越强。龙山县高海拔中蜂种群与低海拔种群均具有较高的遗传多样性，遗传多样性高的原因：其一，地处武陵山脉，植被丰茂，气候温暖湿润，资源相当丰富，适宜中蜂种群生存，能够维持较高的种群遗传多样性；其二，通过实地采样考察，随着精准扶贫，政府鼓励蜂农饲养中蜂，导致外来蜂群涌入当地，外来蜂群等位基因的渗入也是当地遗传多样性高的原因之一。

多态信息含量(PIC)是衡量群体内遗传变异程度的指标，其数值的高低与群体内遗传变异的大小成反比，数值高，遗传变异则大，反之则群体内遗传变异就小(廖信军等,2006)。当PIC>0.5时，该位点为高度多态位点；当0.25

本研究利用11对荧光标记微卫星引物的分析结果表明，龙山县高海拔与低海拔中蜂种群之间的Pi,He,PIC和Fis均无显著性差异，说明在龙山县高海拔与低海拔对中蜂种群遗传多样性无明显影响。生活在不同海拔的中蜂种群，为了适应环境，致使基因组区域发生改变(Montero-Mendieta,2019)，但本研究得出结论种群遗传多样性无明显变化，即中蜂种群为适应海拔因素的变化使得基因组区域发生改变，也不会在很大程度上影响中蜂种群的遗传多样性。同时Montero-Mendieta(2019)中高海拔中蜂种群等位基因数相比于低海拔种群的等位基因数略高与本研究结果一致，多的等位基因数可能与高海拔环境的适应相关，对高低海拔适应性机制及相关基因的研究有待诸多学者进一步的研究。