日本血吸虫可溶性虫卵抗原组分的免疫学特异性分析

2020-12-10唐天才石团员袁东波阳爱国郝力力

西南农业学报 2020年8期

唐天才，石团员，袁东波，侯巍，莫茜，尹杰，阳爱国，郭莉*，郝力力*

(1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041；2. 浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，浙江杭州 310021；3. 四川省动物疫病预防控制中心，四川成都 610041)

【研究意义】血吸虫病(Schistosomiasis)是一种危害严重的人畜共患寄生虫病，全球血吸虫病人在2亿以上，受威胁的流行区人口7亿多[1-2]，而日本血吸虫(Schistosomajaponicum)是导致血吸虫病的三种病原体之一。四川省气候温暖潮湿，年平均气温16 ℃，年平均降雨量1000 mm左右，每年无霜期一般大于300 d，非常适宜日本血吸虫中间宿主钉螺孳生繁殖。血吸虫病流行于全省11个市、63个县、622个乡、4599个村，流行村总人口1058.31万人，有螺面积26 800 hm2。四川省经过多年综合防治，2008年全省达到血吸虫病传播控制标准[3]，2015年底全省实现了血吸虫病传播阻断的目标[4]，但仍然存在诸多问题和挑战，例如：依靠治标措施达标，综合治理覆盖不够，存在疫情反弹风险，部分综合治理环境疫情回升[5-6]，人群和家畜流动性大，传染源管理困难。由于S.japonicum易感宿主广泛(涉及40多种哺乳动物)，传染源和中间宿主尚不能有效根除，日本血吸虫病仍面临着随环境气候变化而死灰复燃的可能性，其诊断和防治工作仍然不能松懈，因此，快速有效诊断是血吸虫病及时防治的前提。【前人研究进展】目前，日本血吸虫病诊断方法可概括为病原形态学、分子生物学和免疫学三大类。其中，病原形态学诊断是最为经典，但费时、费力，漏检率较高，不适合家畜血吸虫病的普查，而分子生物学方法因操作复杂且需要昂贵设备仅限于实验室使用[7-8]；免疫学诊断方法是目前家畜血吸虫病普查最常用的方法，其诊断抗原通常为S.japonicum可溶性虫卵抗原(soluble egg antigen, SEA)，这与虫卵能够诱导宿主产生高水平Th2型免疫应答和特异性抗体密切相关[9-10]。【本研究切入点】由于SEA组分复杂，在实际应用时易与其他寄生虫抗原发生交叉反应而降低其特异性。【拟解决的关键问题】因此，深入分析并鉴定S.japonicumSEA组分的免疫特异性，是获取特异性诊断抗原并对其基因进行克隆、表达的前提工作。

1 材料与方法

1.1 虫卵和血清

已经纯化、脱脂和烘干处理后的S.japonicum虫卵(购自安徽医科大学)，感染S.japonicum第45天的阳性病牛血清(上海市国家动物医学研究所赠)，健康牛血清(采自马边县)。

1.2 主要试剂耗材

兔抗牛IgG-hrp,Western-blot工作浓度1∶1000～1∶5000，ELISA工作浓度1∶20 000～40 000北京博奥生物技术有限公司；宽范围蛋白质分子标准：200、105、79、51、31、15和2 KDa，鼎国生物技术有限公司；增强型ECL发光试剂盒, 南京凯基生物科技发展有限公司；WHATMAN硝酸纤维素(NC)膜，上海索莱宝生物技术有限公司；Pharmac葡聚糖凝胶G-200，上海索莱宝生物技术有限公司。

1.3 主要仪器设备

蛋白质电泳和转印成套设备(BIO-RAD，美国)；蛋白质层析系统(GE Healthcare,美国)。

1.4 日本血吸虫可溶性虫卵抗原的制备

1.4.1 用于SDS-PAGE和Western-blot的日本血吸虫可溶性虫卵抗原的制备称取S.japonicum虫卵0.1 g(含虫卵2.8×106个)至小离心管，于液氮中冷却5 min，然后将虫卵倒入液氮预冷过的研钵中，向研钵中缓慢加入液氮，边加边研磨，至虫卵镜检完全破裂，将虫卵粉末转移至新的离心管，向离心管中加入400 μl SDS-PAGE上样缓冲液，沸水中反复煮3次，每次10 min，期间冰浴2 min，最后，12000 r/min离心2 min，取上清备用。

1.4.2 用于葡聚糖凝胶层析的日本血吸虫可溶性虫卵抗原的制备称取S.japonicum虫卵1 g，玻璃匀浆器研磨30 min，用灭菌生理盐水配成5 %悬液，置4 ℃浸泡3 d，期间于-20 ℃和室温间反复冻融10次，然后超声裂解30 min(400W)，12 000 r/min离心1 h，取上清备用。

1.5 SDS-PAGE和Western-blot分离日本血吸虫可溶性虫卵抗原

分别制备12 %的分离胶和5 %的浓缩胶，胶厚度为1.5 mm,上样量为20 μl,分别用分离胶80 ν和浓缩胶100 ν恒压分离样品。

半干式转移电泳将凝胶上的蛋白质条带转到NC膜上(该转移缓冲液包含47.88 mmol/L的Tris、38.63 mmol/L的甘氨酸、1.28 mmol/L十二烷基硫酸钠和20 %的甲醇)；NC膜在去离子水中漂洗后，将其放入5 %脱脂奶粉TBST中4 ℃过夜封闭，然后与用1∶100倍稀释的S.japonicum阳性病牛血清于37 ℃孵育60 min，TBST洗膜3次后再与1∶2000稀释的兔抗牛IgG-hrp于37 ℃作用60 min, TBST洗膜3次，最后用ECL化学发光显影和定影。

1.6 葡聚糖凝胶G-200柱层析分离日本血吸虫可溶性虫卵抗原

称取3 g葡聚糖凝胶G-200至烧杯中，加入去离子水300 mL，室温过夜溶胀，次日更换去离子水，沸水浴1 h，冷却后装柱，然后用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.9)平衡过夜，向已平衡的柱内加入日本血吸虫虫卵可溶性抗原，每次2 mL，约为柱体积的5 %，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.9)洗脱抗原，流速为0.25 mL/min，分别收集Ⅰ峰、峰间和Ⅱ峰抗原组分，-20 ℃保存备用。

1.7 Dot-ELISA鉴定日本血吸虫可溶性虫卵抗原组分

各层析抗原组分分别点膜，1 μg/点，室温放置1 h，然后将膜置于1 % BSA-PBST中4 ℃过夜封闭，PBST洗膜3次，每次5 min，与1∶100倍稀释的S.japonicum阳性病牛血清室温振荡作用1 h，PBST洗膜3次，每次5 min，与1∶20 000倍稀释的羊抗牛IgG-hrp室温振荡作用1 h，PBST洗膜3次，每次5 min，ECL化学发光显色。

2 结果与分析

2.1 SDS-PAGE与Western-blot结果

SDS-PAGE分析结果显示，SEA所包含主要蛋白条带有10条，分子量大小依次约为100、80、60、55、45、28、27、17、15和13 KDa(图1)；Western-blot对其鉴定结果显示，SEA与日本血吸虫阳性血清出现了3条特异性反应条带，其中，在28和17 KDa位置条带较为明显，在50 KDa位置的反应条带较弱(图2)。

M：蛋白标志物；SEA：日本血吸虫虫卵可溶性抗原 M：Protein molecular weight；SEA：Soluble egg antigen图1 日本血吸虫虫卵可溶性抗原SDS-PAGE电泳图 Fig.1 SDS-PAGE analysis of soluble egg antigens of S.japonium

+：阳性血清；-：阳性血清 +：Potive sera；-：Negative sera图2 日本血吸虫可溶性抗原免疫印迹鉴定Fig.2 Western blot analysis of soluble egg antigens of S.japonium

图3 日本血吸虫可溶性虫卵抗原葡聚糖凝胶G-200柱层析分离Fig.3 Chromatographic separation of soluble egg antigens of S.japonium with sephadex G-200

2.2 葡聚糖凝层析及Dot-ELISA鉴定结果

葡聚糖凝胶G-200柱层析对SEA分离结果显示，SEA在分离过程中出现了2个非常明显的蛋白质高峰值，分别名Ⅰ峰(时间为4～10 min)和Ⅱ峰(时间为20～30 min，图3)，根据Ⅰ峰和Ⅱ峰出现时间的早晚判断，Ⅰ峰为SEA大分子量蛋白组分，Ⅱ峰为SEA小分子量蛋白组分，对所分离到的SEAⅠ峰、峰间和Ⅱ峰蛋白组分Dot-ELISA鉴定结果显示，Ⅰ峰、峰间和Ⅱ峰蛋白与日本血吸虫阳性血清均出现了较强的反应，反应斑点明显，但Ⅰ峰和峰间蛋白与阴性对照血清间也存在不同程度的反应，而Ⅱ峰蛋白未与阴性对照血清出现可见反应(图4)，表明，Ⅱ峰蛋白是能够用于血吸虫病诊断的特异性抗原。

图中斑点1、2和3所用抗原分别为Ⅰ峰、峰间和Ⅱ峰抗原，Sj+1、Sj+2和Sj+3表示一抗反应血清为日本血吸虫阳性血清，Normal 1、Normal 2和Normal 3表示一抗反应血清为阴性对照血清 Dot 1, 2 and 3: Antigens corresponding with I peak, between I and II peak and II peak;Sj+1,Sj+2 and Sj+3: Primary antibodies from positive sera; Normal 1,Normal 2 and Normal 3: Primary antibodies from negtive sera图4 日本血吸虫虫卵可溶性葡聚糖凝胶G-200柱层析抗原Dot-ELISA鉴定Fig.4 Dot-ELISA identification of S.japonium soluble egg antigens separated by gel filtration on Sephadex G-200

图中斑点1、2和3所用抗原分别为Ⅱ峰、Ⅱ峰上清和Ⅱ峰沉淀抗原，Sj+1和Sj+2Sj+3表示一抗反应血清为日本血吸虫阳性血清，Normal 1和Normal 2表示一抗反应血清为阴性对照血清 Dot 1, 2 and 3: Antigen precipitation corresponding with II peak, II peak supernatant and II peak precipitation;Sj+1, Sj+2 and Sj+3: Primary antibodies from positive sera; Normal 1, Normal 2 and Normal 3: Primary antibodies from negtive sera图5 日本血吸虫虫卵葡聚糖凝胶G-200柱层析Ⅱ峰沉淀抗原Dot-ELISA鉴定Fig.5 Dot-ELISA for determination of protein precipitation from II peak separated by gel filtration on Sephadex G-200

SEA特异性抗原组分为小分子量蛋白，主要成分为28、17和50 KDa蛋白，通过葡聚糖凝胶层析的方法能够将包含SEA小分子量的Ⅱ峰蛋白分离出来；Dot-ELISA鉴定结果显示，小分子量蛋白组分峰离心沉淀蛋白组分是非特异性蛋白组分，而Ⅱ峰蛋白中上清蛋白是能够用于日本血吸虫病诊断的特异性天然蛋白(图5)。

3 讨论

目前，在日本血吸虫病血清学诊断中所用到的抗原包括成虫抗原、虫卵抗原和重组抗原等[11-12]，其中，日本血吸虫SEA抗原不仅特异性和敏感性相对较高，而且是日本血吸虫虫卵治病的主要因素，因此已成为日本血吸虫病诊断中最为常用的抗原之一[11]。然而，SEA是日本血吸虫虫卵的蛋白粗提物，所含蛋白质种类繁多[13-14]，且不同提取方法所制备的SEA成分存在差异，这些都会影响到SEA在血清学诊断中的特异性、敏感性和稳定性。因此，本研究通过SDS-PAGE、Western-blot、凝胶层析和Dot-ELISA方法对SEA蛋白组特异性组分进行了分离和分析，其中SDS-PAGE电泳显示主要有10条蛋白带，并且其蛋白组分均为100 KDa以下的小分子量蛋白，这与周晓红等人(2000)[15]报道结果相一致，而不同于朱荫昌等人(1996)[16]的报道。再经Western-blot分析，显示SEA与日本血吸虫阳性血清只出现了3条特异性反应条带，值得注意的是一些SDS-PAGE蛋白带阳性的带用Western-blot分析后呈阴性(如分子质量为100、80、60、45、27和15 KDa蛋白带)，而这些抗原是否都是日本血吸虫虫卵的特异性抗原，还需进一步验证。

葡聚糖凝胶层析是对具有不同大小蛋白进行快速大量分离的一种方法，且不影响所分离蛋白质的活性。Dot-ELISA是以硝酸纤维素膜(NC膜)为固相载体，是对传统ELISA的改进，在传统ELISA准确、快速、特异的优点基础上，更有包被好的诊断膜片在常温保存、携带和运输方便较为便捷，适合基层使用等优点，已被较为广泛的应用于日本血吸虫的研究。蔡世飞[17]运用Dot-ELISA检测慢性日本血吸虫病患者血清IgG；王敏[18]将Dot-ELISA用于急性日本血吸虫病患者的诊断价值的研究；沈定文[19]运用Dot-ELISA快速诊断日本血吸虫病。

本研究利用葡聚糖凝胶G-200柱层析和Dot-ELISA对SEA进行了分析，结果表明小分子量的Ⅱ峰蛋白是能够用于血吸虫病诊断的特异性抗原，而李旭琼等人(1984)早期报道[20]Ⅰ峰蛋白特异性较强，这可能与SEA制备时的方法、步骤不同，以及Ⅰ峰和Ⅱ峰蛋白分离时所采用的葡聚糖凝胶分子大小差异密切相关。另外，所分离到的小分子量蛋白存在一定的浑浊度，通过高速离心对其进行了分离，并对其离心后的蛋白组分进行了深入鉴定，Dot-ELISA鉴定结果显示，小分子量蛋白组分峰离心沉淀蛋白组分是非特异性蛋白组分(图5)，因此，在制备小分子量蛋白抗原时可通过离心的方法将非特异性蛋白组分去掉，从而获得特异性蛋白组分。