赖氨酸特异性去甲基化酶1参与的信号通路在肿瘤领域的研究进展

樊斐,丁杰,,夏宇,吴明,蒋专，,刘航,李显,曾家兴，,张林

【提要】 赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)通过特异性催化组蛋白H3第4位赖氨酸和第9位赖氨酸的脱一甲基、二甲基反应并与组蛋白去乙酰化酶相互作用，起到转录阻遏物的作用。近年来，研究证实LSD1可通过对多条信号通路中相关靶基因的调控，从而影响肿瘤的发生、发展及侵袭转移。本文就LSD1所参与的信号通路在肿瘤领域的研究进展作一综述。

根据2019年国家癌症中心发布的全国最新癌症数据统计，2015年我国共新发恶性肿瘤392.9万例，死亡约为233.8万例，发病率约为285.83/10万[1]。目前认为，细胞从正常细胞转化为肿瘤细胞的主要原因是细胞信号通路调控机制发生紊乱所造成的，其中主要包括Wnt/β-catenin信号通路、Notch信号通路、NF-κB信号通路、PI3K/Akt信号通路、TGFβ/Smads信号通路、Jak-STAT信号通路、Ras-Raf-MAPK信号通路等。

表观遗传学是指在基因的DNA序列没有发生改变的情况下，基因功能发生了可遗传的变化，并最终导致了表型的变化，主要包括了组蛋白修饰、基因组印记、DNA甲基化、非编码RNA、核小体定位、染色质重塑等。在真核细胞中，组蛋白修饰包括了甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、SUMO化(sumoylation)等。过去认为组蛋白的甲基化是一个不可逆的、永久性的组蛋白标记，直到2004年Shi Y课题组第一次发现并确认了组蛋白去甲基化酶—赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1(lysine specific demethylase 1,LSD1)，证明了组蛋白的甲基化修饰和其它组蛋白修饰一样，是一个可逆的过程[2]。

1 LSD1结构与功能

LSD1又名KDM1、KIAA0601、AOF2、NAPO，是一种黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide, FAD)依赖性单胺氧化酶，在真核生物中十分保守。对LSD1进行序列结构分析显示其主要由3个部分组成，包括N端的SWIRM(Swi3p/Rsc8p/ Moira)结构域，中间的Tower结构域和C端的胺氧化酶结构域(amine oxidase like, AOL)。Tower结构域由两个α螺旋组成，位于AOL两叶之间，把AOL一分为二，分别为FAD结合域和底物结合域，形成催化活性中心，统称为LSD1的活性区域。Tower结构域对LSD1与其它蛋白相互作用发挥重要作用，对于维持LSD1的生物活性具有重要意义。LSD1非共价结合辅酶FAD，可特异性去除组蛋白H3第4位赖氨酸(H3K4)和组蛋白H3第9位赖氨酸(H3K9)的一甲基、二甲基修饰，从而影响基因的表达。

2 常见信号通路的组成与作用机制

2.1 Wnt信号通路组成与作用机制

Wnt信号通路作为一种在进化中高度保守的信号通路，参与了机体多种生物学过程的调控，包括了生长、发育、能量代谢、组织稳定和干细胞维持等。细胞内的Wnt通路主要由以下几种蛋白构成：Wnt蛋白(Wnt配体)；Wnt受体；Dishevelled(Dsh/Dvl)蛋白；β-连环蛋白(β-catenin)；糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)；轴蛋白或传导蛋白(Axin/Conductin)；APC蛋白(adenomatous polyposis coli)等。

Wnt信号通路可分为经典通路和非经典通路。经典信号通路也称为Wnt/β-catenin信号通路，由Wnt蛋白与相应的膜受体Frz(frizzled)及低密度脂蛋白相关受体蛋白5/6(low-density lipoprotein-receptor-related protein 5/6, LRP5/6)组成的二聚体受体结合启动，激活细胞内的Dsh蛋白，活化的Dsh蛋白使GSK3β磷酸化而失活，导致APC-Axin-GSK3β介导的β-catenin降解过程受到抑制，使β-catenin在细胞质中积累，然后转移至细胞核内，与T细胞转录因子(T cell factor,TCF)结合形成复合体后，调控下游靶基因的表达，从而调控细胞增生与凋亡。非经典Wnt信号通路包括Wnt/Ca2+通路和Wnt/JNK通路。

2.2 Notch信号通路的组成与作用机制

Notch信号通路广泛存在于脊椎动物及非脊椎动物，且在进化上高度保守，其通过相邻细胞间相互作用调节细胞、组织、器官的分化和发育。不仅可以调节干细胞的细胞命运和增殖，还可以调节邻近细胞之间的旁分泌信号。同时，Notch信号通路关键分子的基因突变在肿瘤的发生、发展过程中具有重要作用[3]。Notch信号通路由Notch受体(Notch1-4)、Notch配体(Delta-like1、3、4，Jagged1-2)、转录因子CSL(CBF-1、Suppressor of hairless、Lag的合称)、其他的效应物和相关调节分子组成。

Notch信号通路活化分为经典Notch信号通路和CSL非依赖途径。经典的Notch信号通路又称为CBF-1/RBP-Jk依赖途径：①Notch基因编码的Notch受体前体蛋白在核糖体合成以后，在高尔基体内第一个裂解点(S1)被furin样转化酶裂解为两个亚基，并以二硫键连接在一起形成异二聚体形式的Notch受体，后被转运至细胞膜。②Notch受体与配体结合后，在金属蛋白酶/肿瘤坏死因子-a作用下在第2个裂解点(S2)裂解为2个片段，水解下的N端产物(胞外区)被配体表达细胞内吞。③C端裂解产物进一步在跨膜区第3个裂解点经由早老素1/2 (presenilin 1/2,PSEN1/2) 、Nicastrin、早老素增强子2 (presenilin enhancer 2,PEN2) 、APH1(Anterior pharynx defective 1)和γ-分泌酶组成的多蛋白联合体酶切释放Notch细胞内片段 (notch intracellular domain,NICD) 至细胞质中。④NICD进入细胞核，通过RAM(RBP-j kappa associated molecular)结构域和cdc/ankyrin重复序列结合CSL蛋白并募集核转录激活蛋白家族MAML(mastermind-like family members)形成三元络合转录激活物进而激活靶基因的转录。此外，有报道指出还存在一种CSL非依赖的Notch信号激活途径，但其具体机制有待进一步研究。

2.3 PI3K/AKT信号通路的组成与作用机制

磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸-苏氨酸激酶(phosphateidylinositol 3 kinase/serine-threonine kinase,PI3K/AKT)信号通路是具有酶活性的细胞内信号通路，在细胞增殖、转化、凋亡及肿瘤发生、发展中具有重要作用。磷脂酰肌醇-3-激酶((phosphateidylinositol 3 kinase,PI3K)家族成员根据结构和功能可分为I型、II型、III型，目前研究最为广泛的是可被细胞表面受体激活的I型PI3K。根据细胞表面的受体不同，I型PI3K进一步分为IA与IB两种亚型，分别从G蛋白偶联受体(G Protein-Coupled Receptors, GPCRs)和酪氨酸蛋白激酶受体(receptor tyrosine kinases, RTKs)接受传递信号[4]。IA型PI3K是由催化亚基p110和调节亚基p85所构成的异源二聚体，IB型PI3K由催化亚基p110γ和调节亚基p101组成。AKT是PI3K下游最重要的信号分子，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，包括AKT1、AKT2、AKT3三个成员。AKT分子由N端到C端包括了PH结构域、中心催化结构域和羧基端的调节结构域。

当外界信号刺激细胞膜表面受体时，PI3K被激活并在细胞膜上产生第二信使三磷酸(3,4,5)磷脂酰肌醇(phosphatidylinostol-3,4,5-triphosphate,PIP3)。PIP3与细胞内含有PH结构域的信号蛋白AKT结合，使得AKT转位于细胞膜，进而促使细胞膜上的PI3K依赖性激酶1(3-phosphoinositide dependent kinase-1,PDK1)催化AKT的Thr308位点磷酸化，同时引起PI3K依赖性激酶2(3-phosphoinositide dependent kinase-2,PDK2)催化AKT的Ser473位点磷酸化导致AKT完全活化。活化的AKT从细胞膜脱落进入细胞质或细胞核，通过磷酸化作用激活或抑制下游靶蛋白Bad、Caspase-9、mTOR、NF-κB、P21、GSK3β、叉头框转录因子家族等，从而调控细胞生长、分化、凋亡、血管生成等。此外，PI3K/AKT信号通路可受类脂磷酸酶PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10)和SHIP2(SH2-containing inositol 5-phosphatase)的负反馈调节，它们可分别使第二信使PIP3的3′和5′去磷酸化而降解，从而阻断AKT及下游效应分子的有效活化。

3 LSD1参与的常见信号通路与肿瘤

3.1 LSD1参与的经典Wnt信号通路与肿瘤

3.1.1 LSD1参与的经典Wnt信号通路与肝癌 原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率有增高趋势，死亡率位居我国恶性肿瘤第二位。癌症起始细胞(cancer initiating cells, CICs)负责恶性肿瘤的无限制细胞生长和化学抗性。研究证实，富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(leucine-rich repeat containing G-protein coupled receptor 5,Lgr5)是Wnt/β-catenin信号通路的靶基因，其大量表达与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的进展有关[5]。Lgr5(+)HCC细胞的行为类似于CICs，具有高度的致瘤性和对化疗药物的耐药性。LSD1可通过对组蛋白去甲基化修饰抑制多种Wnt/β-catenin通路负调控蛋白如Prickle1、APC、SFRP5的表达，从而激活Wnt/β-catenin通路，维持Lgr5(+)HCC细胞的自我更新和耐药性。

酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼是一种新型的靶向肿瘤治疗药物，其治疗的耐受性好，被CFDA批准用于不能手术的晚期肝癌患者治疗。然而其临床应用经常受到耐药性发展的阻碍，研究证实肿瘤耐药性与肿瘤干细胞(cancer stem cell, CSC)亚群的出现有关[6]。Huang等[7]研究显示LSD1活性是长时间索拉非尼治疗后出现肿瘤干细胞亚群所必须的，LSD1过表达导致的组蛋白去甲基化诱导肿瘤干细胞产生及其对索拉非尼的抗性。而LSD1抑制剂如帕尔吉兰可激活多种Wnt通路抑制剂如Prickle1，APC，Sfrp5从而下调索拉非尼耐药细胞中Wnt/β-catenin通路活性，显著抑制索拉非尼抗性HCC细胞的干细胞样特性。这些发现表明LSD1抑制剂可用于减轻索拉非尼的获得性耐药性，从而提高索拉非尼在HCC患者中的治疗效果。

3.1.2 LSD1参与的经典Wnt信号通路与结肠癌 据世界卫生组织国际癌症研究中心发布的2018年全球癌症数据报告，结直肠癌是世界上第三常见的恶性肿瘤，死亡率位居第二位[8]。我国每年约有20万人死于结肠癌，给人民的健康带来严重威胁。一项基于TCGA数据库的研究表明，大约93%的结肠癌患者存在Wnt通路的异常活化[9]。DKK(Dickkopf)家族是Wnt/β-catenin通路拮抗剂，属于外分泌型糖蛋白，包括DKK1，DKK2，DKK3，DKK4四个成员。研究表明，LSD1可通过调节DKK家族中的DKK1影响Wnt/B-catenin信号通路活性，从而影响结直肠癌的发生、发展[10]。关于LSD1调节DKK1的机制，目前认为存在两种可能：①LSD1通过与多种分子伴侣相互作用导致H3K4去甲基化从而抑制目标基因的转录[11]；②LSD1稳固DNA甲基转移酶1(DNA methylatransferase1,DNMT1)导致DNA CpG二核苷酸甲基化从而抑制目标基因转录[12]。其具体机制仍待进一步研究。

3.1.3 LSD1参与的经典Wnt信号通路与胃癌 胃癌是我国最常见的消化系统恶性肿瘤，发病率高且预后较差。随着表观遗传学的兴起，组蛋白修饰与胃癌的关系已成为目前研究热点。詹倩娜等[13]发现与正常组织相比，胃癌组织中的LSD1及Wnt3a表达均明显升高。进一步研究发现，在胃癌细胞中，LSD1通过调控PORCN基因的转录从而影响Wnt3a的分泌进而影响Wnt/β-catenin通路活性，进一步影响胃癌细胞的侵袭和转移。

3.2 LSD1参与的Notch信号通路与肿瘤

3.2.1 LSD1参与的Notch信号通路与小细胞肺癌 小细胞肺癌(small cell lung carcinoma, SCLC)是一类神经内分泌癌，与非小细胞肺癌相比，小细胞肺癌具有恶性程度高、侵袭性强、易发生转移的特点。目前其治疗选择非常有限，患者经过治疗后往往产生化疗耐药从而导致病情复发，因此迫切需要新的靶向治疗。通过对人类小细胞肺癌基因组测序，我们发现编码Notch受体的基因出现失活突变，表明NOTCH信号在小细胞肺癌中具有肿瘤抑制作用[14]。前期研究发现LSD1抑制剂对小细胞肺癌具有一定抑制作用[15-16]，但其具体作用机制仍不清楚。Augert等[17]最近报道了一类新的、高效的、不可逆LSD1抑制剂ORY-1001，对小细胞肺癌细胞亚群具有明显的抗增殖作用。其研究表明LSD1可通过与Notch1位点结合，抑制Notch1表达和Notch信号传导，而LSD1抑制剂ORY-1001则通过调节LSD1-NOTCH-ASCL1轴抑制小细胞肺癌的发生、发展。神经母细胞特异性转移因子(Achaete-scute homolog 1,ASCL1)是一种促进神经内分泌转录程序的转录因子，是肺神经内分泌细胞发育和SCLC细胞所必需的转录因子。Augert A的研究表明ORY-1001通过抑制LSD1活性激活Notch通路，导致转录因子ASCL1抑制从而抑制小细胞肺癌的发生、发展。更为重要的是该研究发现在耐药的小细胞肺癌患者来源的异种移植模型中，ORY-1001诱导的Notch信号激活可产生持久的、完全的肿瘤抑制作用。这一发现，无疑为小细胞肺癌的靶向治疗提供了新的方向。

3.2.2 LSD1参与的Notch信号通路与食管鳞状细胞癌 食管鳞状细胞癌是常见的消化道肿瘤之一，具有侵袭性强、易复发的特点，整体预后较差。其中LSD1和Notch信号通路的异常激活对食管鳞状细胞癌的进展均具有重要作用，但是两者是否互相影响、共同调控，目前尚无定论。有课题组研究[18]表明，在食管鳞状细胞癌中LSD1功能受抑制后，Notch信号通路也受到抑制，表明LSD1可能通过调控Notch信号通路的活性，从而影响食管癌的发生、发展。进一步的研究显示，LSD1可能通过与Notch通路靶基因Hes1的启动子区域结合，从而调控Notch信号通路.Hou[19]等人研究发现LSD1可以与Notch3、Hes1(hairy and enhancer of spilt-1)和CR2的启动子区结合，而利用环丙溴胺或shRNA抑制LSD1后可降低食管鳞状细胞癌细胞内Notch信号通路相关蛋白的表达，从而证实在食管鳞状细胞癌内，LSD1可能通过结合Notch通路相关基因的启动子区域而积极调节通路活性。此外，Lu等[20]报道了一种新型Notch信号通路抑制剂FLI-06在食管鳞状细胞癌中可以抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡和G1期细胞周期停滞。其通过降低Notch3，DTX1和Hes1的表达来灭活Notch通路的同时，也可以抑制LSD1的表达，从而在食管鳞状细胞癌中发挥抗瘤作用，但其具体机制有待进一步探讨。

3.2.3 LSD1参与的Notch信号通路与肝细胞癌 肝细胞癌中的肿瘤干细胞(CSC)被认为与肝细胞癌治疗的耐药性及不良预后密切相关，但其具体的调控机制目前仍不清楚。肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)是肿瘤微环境的主要细胞成分，可通过多种机制促进促进肿瘤进展，包括增加肿瘤细胞增殖、血管生产、肿瘤侵袭、持续性干细胞生长及抑制肿瘤细胞死亡。Liu等[21]人研究发现，CAFs可通过调节Notch3来调控Notch信号，而Notch信号进一步通过诱导SIRT1表达来激活LSD1促进肝脏癌干细胞样细胞自我更新。因此，抑制肝脏肿瘤干细胞中的CAFs/Notch3从而靶向LSD1乙酰化水平，为肝细胞癌的治疗提供了一种潜在的策略。

3.3 LSD1参与的PI3K/AKT信号通路与肿瘤

3.3.1 LSD1参与的PI3K/AKT信号通路与结直肠癌 PI3K/AKT信号通路的突变对于结直肠癌发生、发展具有重要作用。研究显示有超过40%的结直肠癌患者存在突变激活的PI3K/AKT信号通路，导致肿瘤的转移和侵袭增加[22]。结直肠癌最常见的两种PI3K/AKT通路突变是PI3K催化亚基的编码基因PIK3CA的激活和通路抑制因子PTEN的缺失[23]。其中大约25%的结直肠癌患者存在PIK3CA的突变并且与肿瘤的上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)、转移及耐药性密切相关[24-25]。

上皮间质转化(EMT)的激活是癌症进展和迁移的关键机制。结直肠癌包含许多遗传和表观遗传的改变，这些改变可以促进上皮间质转化。Miller等[26]研究证实，对于PIK3CA突变型结直肠癌，LSD1可以通过增强肿瘤细胞中的AKT活性从而激活PI3K/AKT信号通路并且稳定Snail蛋白，从而促进肿瘤细胞的上皮间质转化，推动癌症的进展与转移。

3.3.2 LSD1参与的PI3K/AKT信号通路与胃癌 胃癌患者通常预后较差，大多数患者就诊时已处于晚期状态，此时常伴有肿瘤的转移。淋巴结转移是胃癌最常见的转移形式，也是导致预后不良和复发的重要因素之一。研究显示，LSD1在胃癌组织中高度表达，并且表达水平的改变在胃癌细胞增殖和转移中起重要作用[27]。血管内皮生长因子-C(vascular endothelial growth factor C,VEGF-C)是一种重要的淋巴管生成调控因子，可以诱导淋巴管生成并促进肿瘤的淋巴转移。前期研究表明，VEGF-C介导的PI3K/AKT信号通路的激活在肿瘤的淋巴结转移中起着重要的调节作用[28-29]。VEGF-C与血管内皮生长因子受体-3(vascular endothelial growth factor receptor 3,VEGFR-3)结合并诱导其激活，从而进一步激活PI3K/AKT信号通路，上调基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP2)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP9)的表达并促进淋巴管生成。Pan等[30]研究证实，LSD1可以通过调节VEGF-C影响PI3K/AKT通路活性，促进胃癌的侵袭与转移。下调LSD1活性可以抑制胃癌细胞的侵袭与转移，代表了一种有前途的肿瘤治疗新靶点。

3.3.3 LSD1参与的PI3K/AKT信号通路与前列腺癌 前列腺癌是老年男性常见的恶性肿瘤之一，为雄激素受体依赖性肿瘤。雄激素受体(androgen receptor,AR)是一种配体依赖的核转录因子，对于前列腺癌的发生、发展至关重要，可以驱动前列腺癌进展为去势抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer, CRPC)[31]。在前列腺癌细胞中，LSD1可以介导AR的转录活性从而影响前列腺癌的发生、发展，为利用LSD1抑制剂治疗前列腺癌提供了分子基础。然而，LSD1是否可以调节前列腺癌细胞中其它的肿瘤信号通路目前尚不清楚。最近有研究认为，LSD1可以通过调节PI3K调节亚单位p85的表达，从而激活PI3K/AKT信号通路，促进前列腺癌的发生、发展[32]。因此，LSD1抑制剂可同时靶向AR和PI3K/AKT信号从而延缓前列腺癌的进展。 此外，靶向PI3K酶活性的PI3K抑制剂和LSD1抑制剂的联合治疗可能在治疗前列腺癌患者中实现协同效应，但仍需进一步的临床实验加以验证。

4 结语

近年来，随着对肿瘤领域研究的不断深入，我们发现LSD1所参与的信号通路与肿瘤发生、发展及耐药性的产生密切相关。鉴于LSD1所参与的信号通路在肿瘤中的重要作用，探索LSD1所参与的信号通路与肿瘤发生、发展的相关机制，不仅能为肿瘤的早期诊断提供可靠的分子标志物，也为肿瘤的治疗提供了新的靶标。近年来，除了传统的手术、放疗及化疗，一系列以LSD1及相关信号通路为靶点的治疗药物显示了良好的应用前景。虽然目前大多数靶向药物仍处于临床试验前阶段，缺乏安全性及有效性的评估，但随着人们对肿瘤研究的不断深入及制药工业的发展，在不同层次开发多靶标抗癌药物将会为肿瘤的治疗提供更为有效的方法。