NOD样受体在幽门螺杆菌感染和胃癌中的研究进展

辛洪杰，白杨

【提要】 幽门螺杆菌(H.pylori)感染是全球范围内最常见的病原体感染之一。长期感染H.pylori,潜伏着罹患胃癌及消化性溃疡等疾病的风险。H.pylori致癌机制机制尚不明确，目前认为长期慢性活动性炎症以及炎癌转化是重要因素。近年来发现，NOD样受体(NLRs)广泛存在于人体上皮细胞和免疫细胞中，NLRs的激活和调控在平衡机体固有免疫和炎症反应中发挥重要作用。借鉴NLRs在多种炎症性疾病中的研究，本文对NLRs在H.pylori和胃癌中的相关研究进行综述。

胃癌是世界上第二大癌症死因，是威胁人类健康最常见的恶性肿瘤之一。国家癌症登记中心资料显示，2015年胃癌发病率仅次于肺癌，居所有恶性肿瘤的第2位[1]。2017年全球胃癌病例超过122万，86.5万人被其夺去生命，全球近一半胃癌发生在中国[2]。胃癌的发生发展是一个多因素综合作用的共同结果，其中微生物、环境和宿主遗传因素都不同程度地参与了这个进程。幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,H.pylori)感染是胃癌发生的微生物因素中最重要的因素。早在1994年，世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)已将H.pylori列为第Ⅰ类致癌因子。一项荟萃分析显示根除H.pylori后胃癌发病率下降为0.53，此举对无症状患者和内镜下早癌切除术后患者尤其有益，根除该菌后胃癌风险降低34%，H.pylori已成为胃癌一级预防的靶点[3]。胃癌的病因和发病机制尚未完全明确，目前认为H.pylori感染引起的长期慢性活动性炎症和炎癌转化机制在肠型胃癌(占胃癌极大多数)发病中起重要作用[4-5]。先天性免疫系统作为宿主防御的第一线，首先通过模式识别受体(pattern recognize receptors，PRRs)检测到H.pylori入侵，并促发后续一系列炎症反应以达到清除病原体的目的[6]。核苷酸结合寡聚域(nucleotide binding and oligomerization domain，NOD)样受体(NLRs)作为PRRs的重要成员，近来的研究证实NLRs涉及多种信号通路的激活，能特异性识别多种微生物群体，从而调控宿主与病原体的应答。在此我们主要回顾NLRs信号通路在H.pylori感染和胃癌中的的最新研究进展。

1 NLR家族

先天性免疫(Innate immunity)是指机体在种系发育和进化过程中形成的天然免疫防御功能，即出生后就已具备的非特异性防御功能，也称为非特异性免疫(non-specific immunity)。先天性免疫是机体对多种抗原物质的生理性排斥反应，与此相对应的是适应性免疫(adaptive immunity)，指出生后通过与抗原物质接触所产生的一系列防御功能。PRRs是先天性免疫系统的组成部分，对于检测特定的微生物抗原至关重要。PRRs可依据遗传和功能的差异性划分为五个家族：Toll样受体(TLR)，NOD样受体(NLR)，C型凝集素受体(C-type lectin receptors,CLR)，视黄酸诱导基因(retinoic acid-inducible gene,RIG)-I样受体(RLR)和黑色素瘤2缺失(absent in melanoma 2,AIM2)样受体(ALR)[7]。TLR和CLR可以识别细胞外环境和胞内的病原体相关分子(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)，这些高度保守的微生物结构对于病原体的生存至关重要[8]。NLR家族不仅识别PAMPs，还能识别胞浆中组织损伤或细胞死亡后产生的内源性配体，又叫做损伤相关分子(damage-associated molecular patterns,DAMPs)[9]。NLR的特征结构包括中央位置的核苷酸结合寡聚域(NACHT)，C端配体识别域(leucine rich region,LRR)和N端胱天蛋白酶募集域(caspase recruitment domain,CARD)或吡啶域(pyrin recruitment domain,PYD)，又称效应器结构域。基于效应器结构域的组成分析，NLR家族可细分为五个子家族：酸性反式激活域(NLRA)，包括CIITA；杆状病毒抑制点重复序列，BIR(NLRB)，包括NAIP；胱天蛋白酶募集结构域，CARD(NLRC)，包括NOD1(NLRC3-5)和NOD2；吡啶结构域，PYD(NLRP)，包括NLRP1-14；NLRX1,其定位于线粒体并且与任何已知的N端效应器结构域均不同源[10-12]。LRR结构域是由一段串联重复序列(结构单元为一个β链和一个α螺旋组成)编码生成，大约含有20～30个氨基酸，形成富含疏水性氨基酸-亮氨酸的马蹄形结构[13]，具有配体识别和调控功能。NLRPs LRR基因是一段由171个核苷酸的外显子构成的串联重复序列，可编码一个中心LRR结构域和两个相邻LRR结构域的一半[14]。这个特殊的模块化设计使得NLRPs的LRR结构域可以进行大范围的选择性剪接，从而保证了配体识别单元的最大可变性[8]。胞内腺苷或ATP的产生促进NACHT结构域的寡聚化，这一寡聚化的发生对于NLR的激活是必不可少的，进而形成高分子复合体，可以是具有炎症小体特征的六聚体或七聚体(参与激活胱天蛋白酶以促进白介素(Interleukin, IL)-1β，IL-18以及可能的IL-33的成熟和分泌的分子复合物)，亦或是NOD1或NOD2寡聚化后形成的NOD信号体，其可通过受体相互作用蛋白2(receptor-interacting protein-2,RIP-2)进一步激活NF-κB信号通路。CARD和PYD是效应器结构域，它们均由六个α螺旋组成，可与同一亚族的其他成员形成二聚体或三聚体，功能在于介导同型蛋白之间的相互作用以进行下游信号的转导[8]。

2 炎症小体与焦亡

炎症小体(inflammasomes)是由应激，组织损伤和细胞内感染等途径激活的蛋白复合物，是先天性免疫系统的重要组成部分，目前已被证明和多种疾病的发生发展密切相关[9,15]。NLR受体家族可以识别应激、外源性微生物和内源性危险信号，作为PRR受体家族中为数不多的几个与炎症小体形成有关的成员之一，近些年来备受研究人员关注。其中，NLRP3是炎性小体家族研究中最热门的成员，可被多种病原体、内源性和外源性物质等激活。病原体包括多种病毒、细菌、真菌等；内源性刺激物包括线粒体活性氧(mitochondrial reactive oxygen species，mtROS)、线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)等；外源性刺激物包括二氧化硅、石棉、铝盐等。细菌侵入人体以后，可引起细胞内线粒体损伤，释放mtROS和mtDNA，两者共同作用可激活巨噬细胞内NLRP3炎症小体的合成和组装。NLR受体识别特定的配体后被激活，其作为炎症小体的支架蛋白通过N端的效应器结构域的相互作用(PYD-PYD)募集衔接子凋亡相关的斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)[16]。ASC(也称为PYCARD)由N端PYD和C端CARD构成，是炎症小体形成所需的关键成分[17]。这种相互作用进一步募集到胱天蛋白酶1(Caspase-1)前体蛋白，并诱导Caspase-1前体通过自体蛋白水解作用(自剪切)生成活化体，活化的Caspase-1将IL-1β和IL-18前体剪切活化，并释放到细胞外[18]。Caspase-1(CASP1)是细胞内一种具有天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶。CASP1可以对无活性的前体蛋白进行剪切并将其转化为成熟的炎性细胞因子(IL-1β和IL-18)和成孔蛋白(Gasdermin D，GSDMD)。CASP1将GSDMD的N端剪切下来并诱导进行自体寡聚化，随后在质膜上形成细胞毒性孔，造成胞浆外流，从而导致细胞焦亡[19]。细胞焦亡是细胞程序性死亡的一种方式，其特点在于细胞肿胀，质膜穿孔以及促炎细胞因子(IL-1β和IL-18)的释放[20-21]。细胞焦亡具有双重作用：保护多细胞生物抵御微生物感染和清除内源性危险因子；如果活化过度，会导致病理性炎症，造成机体组织损伤。已发现有两条途径可激活细胞焦亡：NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2参与，Caspase-1介导的炎症小体途径(典型性炎症小体途径)和Caspase-4/5/11介导的炎症小体途径(非典型炎症小体途径)。

3 NLRs在H.pylori感染中的作用

3.1 NOD1和NOD2

首先是NOD1和NOD2，它们均可在黏膜上皮细胞和抗原呈递细胞中表达，能特异性识别肽聚糖衍生而来的多肽[22]。其活化后可诱导NF-κB和AP-1复合体移位到核内进而激活下游信号通路[23]，生成一系列细胞因子(IL-6、IL-8、IL-10等)以及多种趋化因子(CXCL2、CXCL10、CCL2、CCL3、CCL4以及CCL5)，发挥其促炎抗感染的作用，这一途径不需要炎症小体的参与[24]。一项早期研究尝试探索H.pylori将肽聚糖运输进入宿主细胞并被胞内NOD1所识别的相关机制，结果显示H.pylori中Ⅳ型分泌系统(T4SS)的参与至关重要[25]。近来，Hutton等首次提出细胞膜上富含胆固醇的微小结构体，又被称为脂质筏，在Ⅳ型分泌系统介导的肽聚糖递送以及后续的NOD1识别、NF-κB活化和IL-8产生过程中扮演了关键角色[26]。值得一提的是，Kaparakis等相继报道了革兰氏阴性细菌(包括H.pylori)将肽聚糖包裹在外膜囊泡中通过脂质筏进入上皮细胞的一条新途径[27]。大量研究表明，细胞毒素相关基因致病岛(cag pathogenicity island,CagPAI)的存在可以上调NOD1的表达，这种现象在H.pylori感染的多种人类细胞系中都得到了证明[28-29]。此外，研究人员也发现CagPAI阳性菌株可通过IFN-γ信号传导途径中的两个成员STAT1和IRF1激活NOD1信号通路[29]。同样，CagPAI调控的NOD2表达能显著影响H.pylori激活的NF-κB炎症信号通路活性[30]。

3.2 NLRP亚家族

NLRP代表了最大的NLR亚家族(已在人类中鉴定出14个基因)，先前的一些研究证实了NLRP炎症小体相关分子蛋白在H.pylori感染中的重要作用。例如，与野生型小鼠相比，H.pylori感染的ASC缺陷型小鼠表现出更高的细菌载量和显著较低的炎症水平，且无法生成IL-1β或IL-18，IFN-γ的生成较之也更少[31]。Jiang等报道了在H.pylori感染的小鼠中NLRP3炎症小体相关分子的表达以及血清IL-1β、IL-18和IL-33水平均显著增加[32]。在H.pylori感染的人嗜中性粒细胞以及THP1巨噬细胞中，均观察到NLRP3炎症小体活化现象。近来的三项研究证实，在人胃癌细胞系，胃黏膜组织和小鼠模型中均能观察到H.pylori感染的细胞中Caspase-1，IL-1β和IL-18表达量的增加[33-35]。胃黏膜上皮细胞表面相关的糖蛋白-黏蛋白1(MUC1)在细胞表面高度表达，保护上皮内膜免于炎症和感染的侵扰，为宿主抵御病原体提供了有效的物理屏障[36]。不仅仅如此，Sutton等亦证实了MUC1可通过负向调控TLR/NF-κB信号通路来抑制免疫细胞中NLRP3的表达，从而降低H.pylori感染的炎症水平[37]。Withaferin A(WA)，一种从Withaniasomnifera提取的山梨醇化物，被发现可以抑制NF-κB活性进而降低H.pylori感染的鼠源性树突细胞中NLRP3的表达[38]。H.pylori的脲酶被发现具有新型免疫调节剂的作用，可通过树突状细胞中的TLR2信号传导激活NLRP3来预防哮喘[39]。同样是通过诱导NLRP3激活进而促进IL-18分泌，H.pylori感染被认为可以降低炎症性肠病的炎症水平[40]。很少有报道提及H.pylori感染过程中转录组层面上对于炎症小体的调控作用，已经证实了hsa-miR-223-3p通过抑制微小RNA--miR-22可以上调NLRP3炎症小体的表达，这一途径并不需要CagA、VacA、Cgt、FlaA和CagPAI等毒力因子的参与[41]。相比之下，NLRP3以外的参与炎症小体形成的其他家族成员在H.pylori感染过程中所扮演的角色尚不清楚。H.pylori拥有两个鞭毛蛋白亚基FlaA和FlaB，它们构成鞭毛的细丝。除此之外还具有Ⅳ型分泌系统(T4SS)，细菌可以通过该亚单位将产物输入宿主细胞。NLRC4可以识别胞内鞭毛蛋白或细菌分泌系统的组成部分。因此，这些毒力因子可能会诱导NLRC4炎症小体的活化。Raphaela等从野生型小鼠和Nlrc4缺陷型小鼠中分离出原代胃上皮细胞，并用富含CagPAI的H.pylori菌株(PMSS1)与之共培养，在野生型细胞模型中检测到了明显更高水平的IL-18分泌量。值得注意的是，他们还发现缺乏功能性T4SS的SS1菌株诱导IL-18分泌的程度要小得多。这都表明H.pylori感染胃黏膜上皮细胞的过程中，除了功能性T4SS的参与以外，NLRC4炎症小体对于IL-18的表达和分泌也是必不可少的[42]。H.pylori鞭毛蛋白FlaA诱导NLRC4 Ser533位点的磷酸化而下调NLRC4炎症小体的表达，并通过何种机制逃脱了NAIP5的检测等等这些问题尚待解决[43]。

4 IL-1β和IL-18在H.pylori感染中的特性

多条炎症信号转导通路参与到了H.pylori相关的胃部炎症和胃组织病理损伤的过程中，免疫细胞和胃上皮细胞中IL-1β/IL-18的加工和分泌在这里面起到关键作用。令人意想不到的是，这两个Caspase-1诱导生成的细胞因子在调控先天性和适应性免疫反应上具有截然不同的功能，它们可以诱导固有免疫细胞的聚集，引导适应性免疫反应并调节组织稳态，从而影响H.pylori感染患者的预后。

4.1 IL-18

H.pylori感染过程中胃黏膜免疫反应以辅助T细胞1(Th1)型为主，干扰素(IFN)-γ的生成和分泌是该反应特征之一，IL-18可以诱导IFN-γ的释放，促进Th1细胞免疫反应[44]。IL-18被发现在H.pylori感染人群的胃黏膜组织高度表达，而且IL-18的分泌水平与人胃窦活检组织中巨噬细胞数量以及胃炎严重程度呈正相关[45]。这是一个重要发现，因为巨噬细胞是H.pylori感染触发的炎症反应中的前哨免疫细胞群，被认为是慢性胃炎发生发展的关键调控者[46]。有趣的是，早前有研究报道肠道黏膜上皮细胞中IL-18的表达对于组织修复和抗菌肽的生成起到了关键作用，进而避免了共生细菌的扩散，菌群失调和炎症的发生[47-48]。为了更深入地了解IL-18在H.pylori感染中的作用，研究人员开展了基因敲除鼠模型的研究。与野生型小鼠相比，IL-18缺陷型小鼠在较短的时间内出现了严重的免疫病理学相关的胃组织损伤[49]。用IL-18刺激髓样树突细胞(BMDC)能够促进幼稚CD4+T细胞向调节性T细胞(Treg)分化，潜在地限制了H.pylori感染所触发的Th17细胞免疫反应[50]。有研究者认为，IL-18作用后的BMDC可以促进免疫耐受[50]，而且精细调控着胃黏膜组织中炎症的进程。Treg细胞通过多种途径抑制效应T细胞以及抗原提呈细胞的功能，保护宿主细胞免于过度的炎症反应损伤，使机体在免疫反应和炎症反应之间保持平衡[51]。IL-18以及IL-18R缺陷型小鼠模型体内实验表明，在H.pylori感染过程中IL-18对CD4+CD25+Foxp3+Treg的诱导生成起到了关键作用。Treg细胞积极参与到了机体自身免疫耐受的调控过程中[52]，可以表达FOXP3，这一主转录因子由X染色体上的Foxp3基因编码[53]。Foxp3基因的突变将会严重影响Treg细胞的功能，进而导致各种自身免疫性疾病[54]。的确，IL-18R缺陷型乳鼠在感染H.pylori后并没有表现出相关特异的免疫耐受性。这些模型的胃组织中观察到了较高水平的白细胞和T细胞浸润以及较高的IFN-γ和IL-17分泌水平，随之而来的是H.pylori菌量的下降[50]。与这些发现一致的是，在H.pylori和猫属螺旋杆菌(H.felis)感染的Casp1缺陷型小鼠模型中，IL-18的缺乏与较低的细菌定植水平，活跃的Th17细胞免疫反应以及胃炎严重程度密切相关[49]。实际上，我们还必须考虑到H.pylori感染过程中其他性质待确定的炎性介质的潜在影响，而目前的研究成果还不足以完成准确的论断，仍需要进一步的工作。

4.2 IL-1β

IL-1β的主要来源为固有免疫细胞(如单核细胞，树突状细胞和巨噬细胞)，可以调控环氧化酶(COX)-2的表达，促进前列腺素2(PGE2)的大量合成，抑制IFN-γ的产生。通过抑制IFN-γ和Th1型免疫反应，IL-1β可引导机体免疫往Th17细胞免疫反应方向发展[55]。相关研究表明，IL-1β及其受体IL-1R1对于Th17细胞免疫应答的早期分化很重要[56]，而IL-1β在与IL-23的协同作用下可以放大Th17细胞免疫效应[57]。目前普遍认为针对H.pylori的特异性Th1或Th17细胞免疫应答是机体保护性免疫力的来源，Th17细胞释放时间较Th1稍晚，都具有增强黏膜炎症反应的能力，但细胞免疫反应的过度激活也可能在H.pylori感染过程中造成胃黏膜免疫损伤，带来组织病理上的变化，逐渐形成慢性浅表性胃炎，萎缩性胃炎，肠上皮化生以及异型增生[58-59]。同样，IL-1β在H.pylori感染者胃组织中的表达量，与黏膜炎症水平密切相关[60]，重度炎症反应造成组织细胞反复破坏与修复是萎缩性胃炎、异型增生和胃癌等病变的始因[61]。IL-1β通过正反馈回路促进IL-8表达，它也是NF-κB信号通路调控下的重要产物，反过来，IL-8又可以驱动中性粒细胞在胃黏膜中的聚集，渗透和活化[62]。IL-1β也能诱导活性氧(ROS)的产生，继而驱动NF-κB信号传导，同时伴随有CXCL8高度表达，它能激活MAPK-NF-κB信号通路进一步增强人胃癌细胞的转移和侵袭力[63]。IL-1β除了是促炎细胞因子外，还有强效抑酸作用，往往能导致胃酸分泌过低(胃酸总输出量低)，促进胃癌的发展[64]。此外，越来越多的研究也开始关注IL-1β基因多态性对胃癌易感性的影响，这是后续工作的重点方向。如何调控H.pylori感染过程中IL-1β和IL-18的表达使机体免疫反应和炎症反应趋于平衡并最终达到预防胃癌的目的，炎症小体-胱天蛋白酶-1信号通路相关分子的单克隆抗体或天然抑制剂的研发具有重大意义。

5 NLRs与胃癌的关系

H.pylori致癌是一个多阶段、多基因变异、多因素参与的过程，其中过度或失控性炎症反应是一个重要方面。Allison等发现，与正常组织相比，胃炎组织中NOD1表达显著增加。同样，在胃肿瘤组织与非肿瘤组织的比较中也是如此[29]。相反，Jee等提到Caspase-1表达的降低与预后不佳关系密切，并与p53表达成负相关[65]。Mitchell等分别使用H.pylori菌株GC026(源自胃癌组织)和26695(源自胃炎组织)感染THP-1来源的巨噬细胞，目的在于评估NLR信号通路中的84个分子的基因表达情况[66]。结果表明，在H.pylori感染的细胞中，编码NLR的五个基因(NLRC4、NLRC5、NLRP9、NLRP12和NLRX1)的表达受到影响。有趣的是，在GC026菌株感染的细胞中，两个已知的NF-κB负调控基因(NLRP12和NLRX1)显著下调，而NFKB1和一些NF-κB靶基因如编码促炎因子的基因(IFNB1、IL-12A、IL-12B、IL-6和TNF)，趋化因子(CXCL1、CXCL2和CCL5)和促癌基因(PTGS2、BIRC3)明显上调。这些发现凸显了NLR信号通路与胃癌发生发展的紧密联系[66]。

NLR受体基因具有多态性，即具有多个等位基因，不同的等位基因编码的NLR受体蛋白活性有差异。NLR受体基因多态性可使机体对外界环境(如H.pylori感染)有所不同，这是决定机体胃癌易感性的一个重要因素。NLR受体基因多态性与胃癌易感性的研究日渐增多，大部分聚焦于NOD1和NOD2。目前相关研究报道了在不同人群中，存在多个NOD1和NOD2基因位点差异与罹患癌前病变和胃癌风险相关。此外，Liu等进行的一项荟萃分析(纳入了6个病例对照研究)显示，NOD2三个基因位点的差异(R702W、G908R和L1007insC)与罹患胃癌风险相关[67]。Mitchell等报道了在中国胃癌高风险人群中NLR信号通路中6个分子(NLRP3、NLRP12、NLRX1、CASP1、ASC和CARD8)的51个基因位点差异与罹患胃癌风险相关[66]。其中首次提到了CARD8的rs11672725位点序列差异与胃癌发生相关，以及NLRP12的rs2866112位点与H.pylori感染的关系密切[66]。此外，也证明了NLR信号通路分子(CARD8、NLRP3、CASP1和NLRP12)基因多态性和H.pylori感染的同时存在，大大增加了中国人罹患胃癌的风险[66]。NLR信号通路相关分子基因多态性在胃癌中的研究仍是一个相对较新的领域，因此需要更全面，更系统的研究来评估不同人群中，尤其是胃癌高风险人群，相关分子基因多态性与胃癌易感性的关系。

6 结语

目前，大量研究强调了炎症小体信号通路及其下游产物IL-1β和IL-18在H.pylori诱发胃组织病理损伤中的重要性，但仍然存在许多问题亟需解决。尽管针对这些细胞因子的免疫疗法已被用于治疗多种炎症性疾病，然而对于H.pylori感染和胃癌而言，这种策略的可行性尚待确定。更好地了解H.pylori及其毒力因子调控不同细胞中IL-1β和IL-18生成和释放的上游机制，才能让我们在处理宿主免疫反应平衡的问题上更进一步。

总体而言，NLR受体基因多态性在胃癌防治方案中应加以重视，虽然尚不能通过改变其易感的基因型来防治胃癌，但可以通过NLR受体信号通路相关基因检测，预测个体发生胃癌的风险，采取相应的措施如根除H.pylori或调控基因表达以达到有效预防胃癌的目的。